激光诱导荧光LIF之令狐文艳创作

LIF测量原理
令狐文艳
一、光致发光物理基础
发光可以定义为原子或分子从激发态到较低能态经历的辐射发射过程。

如果激发态是通过吸收入射辐射产生的，那么源于这种激发态的发射就称为光致发光。

1. 分子轨道理论
根据分子轨道理论，两个原子轨道结合时既可以形成成键分子轨道（bonding molecular orbit），又可以形成反键分子轨道（anti-bonding molecular orbit）。

基态时分子中的电子占据成键轨道，有机分子中原子间电子云以头碰头形式形成的单键分子轨道叫做轨道，相应的电子叫电子；肩并肩形式形成的分子轨道叫轨道，相应的电子叫电子。

相应的反键轨道分别用*和*表示。

另外还有很多物质还含有非键轨道（non-bonding electron），即未共用电子或孤电子对，用n表示。

当吸收一定能量后，一定能级之间的电子可发生下图所示的四种跃迁：->*、n->*、n->*、->*。

分子轨道及电子能级跃迁
2. 单线态和三线态
电子的自旋状态可以用自旋多重度表示，对于基态的原子，对于一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反的自旋方向，因此自旋多重度总等于1，称为单线态；当一个电子被激发到
能量较高的电子态时，激发态可能是单线态，也可能是三线态。

从单线态激发称为三线态的概率是相当低的，较单线态要低若干个数量级，三线态的寿命比单线态长得多。

3 激发光谱和发射光谱
荧光现象属于光致发光，涉用到两种辐射，即激发光（吸收）和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。

这是荧光定性和定量分析的基本参数及依据。

1）激发光谱
通过测量荧光体的发光通量（即强度）随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。

激发光谱的具体测绘方法，是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光体，发出的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。

2）发射光谱
通过测量荧光体的发光通量随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。

其测绘方法，是固定激光发光的波长，扫描发射的光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。

物质的发射光谱也称为荧光光谱（或磷光光谱）。

3）激发光谱和发射光谱的特征
a荧光发射光谱的形状与激发波长无关
由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振
动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。

因此荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。

b 荧光激发光谱的形状与发射波长无关
荧光发射的效率（称为量子产率）与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。

4. 荧光（或磷光）量子产率
激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射跃进迁过程，辐射跃迁可发射荧光（延迟荧光）或磷光。

而有多少比例的激发分子发射出荧光（或磷光）呢？可以用荧光量子产率ΦF --有时也叫荧光效率或荧光产率（或磷光量子产率φP ）表示。

φF 定义为：荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比，即:
吸收的光量子数发射的光量子数
=F φ或吸收荧光的分子数发射荧光的分子数
=F φ
许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去激发（去活）过程中，除发射荧光（磷光）外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。

所以，荧光量子产率与其他各种过程的速率常数有关。

ΦF 可以表示为:
式中，ΣK i为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即
ΣK i＝K IC＋K ISC＋K Q[Q]。

从上式可以看出，凡是能使K f值升高而使其它K i值它降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。

对于高荧光分子（如荧光素）来说，Φf接近于1，说明该分子的K f较大，ΣK i相对于K f不可忽略不计。

一般荧光物质Φf小于1，不发荧光的物质K f为0，Φf＝0。

一般说来，K f主要取决于化学结构（上节已叙述），K i则主要取决于化学环境因素，同时也与化学结构有关。

从各种速率常数还可以得到荧光寿命τf:
磷光的量子产率ΦP与荧光最子产率相似。

5. 荧光强度与荧光物质浓度的关系
荧光强度I f正比于吸收光量（光强）I a及荧光量子产率
Φf:
I f=I aΦf
吸收的光量（光强）I a应为入射光强I0与透射光的光强I t 之差，即：
I a＝I0－I t
根据吸收定律（朗伯-比耳定律）：
所以
式中，ε为摩尔吸光系数，b为样品溶液光程（即液池厚度），c为样品摩尔浓度。

当浓度c很小，吸收光量不超过总光量2％时，05.0<
ε
bc
（约为0.02），则展开式的高次项可忽略，即:
所以：
当I0及b一定时:I f＝Kc
上式表明，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。

但是应该注意此式只适合于荧光物质的稀溶液，当c较大，即05.0>
ε时线性关系将受到破坏。

其原
bc
因是受激后激发态分子与体系中其他分子碰撞，使其以非辐射跃迁形式去激化（去活），产生荧光猝灭或者激发态分子所发射的荧光被没受激发分子吸收，而又因Φf一般少于1所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光减弱。

6. 荧光的猝灭
荧光的猝灭（熄灭）从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。

从狭义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。

与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质称为猝灭剂，荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。

猝灭主要有为下几种类型：
1）碰撞猝灭
碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。

它指的是处于激发单重态荧光分子*1M与猝灭剂分子Q相碰撞，使*1M释放热量给环境以无辐射形式跃迁回基态，产生猝灭作用（这种猝灭也称动态猝灭）。

这一过程可以表示如下：
碰撞猝灭效应随温度升高而增强，而随粘度增大而降低。

2）生成化合物的猝灭
生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示：
从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系
式中（I f）0及（I f）q分别为加入猝灭剂Q之前及之后的荧光强度，C M为荧光物质的总浓度。

上式与动态猝灭的关系式一样，只是常数K的意义不同。

利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。

3）能量转移猝灭
当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这是俗称“内滤作用”。

可用下式表示：
4）氧的猝灭
O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。

对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有效的，它可以导致通常观察不到溶液的室温磷光现象。

而对于溶液荧光来说，不同荧光物质和同一荧光物质和同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同。

氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。

有的认为可能是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光
分子相互作用形成激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的，如下式表示：
也有的认为氧和其它顺磁性物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃（）以及提高荧光物质基态分子的系间吸收跃迁（）的几率；还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。

5）转入三重态的猝灭
在“重原子效应”段落已经叙述，溴化物和碘化物都能产生“重原子效应”，促使荧光分子激发单重态转入激发三重态，导致荧光的猝灭。

上面也已提及氧的猝灭作用也可能是O2促使荧光体分子转入激发三重态所致。

6）荧光物质的自猝灭
当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。

自猝灭可能有如下几个原因：
a 荧光物质分子之间的碰撞能量损失，这实际上是能量的外
部转移形式。

b 荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光
谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S1激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低。

c 荧光物质分子的缔合。

某些荧光体分子处于基态时会形成
二聚体或多聚体，或者激发态分子1与基态分子M形成激发态二聚体1（M*M）。

这些聚合物与荧光单体一般都会具有不同的荧光特性，有的使荧光强度降低甚至不发射荧光，有的使光谱发生变化。

此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等，不一一叙述。