脑心肌炎病毒（EMCV）感染昆明小鼠模型的建立

脑心肌炎病毒（EMCV ）感染昆明小鼠模型的建立①
郑剑纲② 郝至立③ 曹志刚② 孙盼盼②④ 孙
娜② 李宏全②
（山西农业大学动物医学学院，太谷 030801）中图分类号 R392.1 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）10-2232-06
［摘
要］ 目的：建立EMCV 感染昆明小鼠模型。

方法：6~8周龄昆明小鼠，雌雄各半，分为空白对照组和EMCV 高（100
TCID 50/20 g ）、中（10 TCID 50/20 g ）、低（1 TCID 50/20 g ）剂量组。

分别于EMCV 感染5 d 、7 d 、9 d 、11 d 、13 d 、15 d 称重，眼眶采血后，断颈处死。

取心、脑、肝和脾组织，计算各器官脏器指数；qRT -PCR 检测心、脑、脾、肝和外周血病毒载量；qRT -PCR 检测心和脑IL -1β、IL -6和TNF -α mRNA 表达量；取心和脑，HE 染色后观察组织病理损伤。

结果：与空白对照组相比，高剂量的EMCV 感染小鼠5 d 时，能显著提高心脏指数（P <0.05）和极显著提高脾脏指数（P <0.01）；qRT -PCR 结果显示EMCV 感染9 d 时，小鼠心、脑、肝、脾和外周血病毒载量最高，中、低剂量EMCV 感染小鼠各脏器中的病毒载量很低；高剂量的EMCV 感染小鼠9 d 时，心和脑
IL -1β（P <0.01）、IL -6（P <0.001）和TNF -α（P <0.01）极显著升高；9 d 时，高剂量EMCV 引起心脏组织炎症细胞浸润和空泡化病变；5~9 d 时，高剂量EMCV 引起脑组织脑膜增厚、脑膜下血管扩张和出血、脑白质血管扩张形成血管套。

结论：EMCV 攻毒剂量为0.2 ml 100 TCID 50/20 g 时，成功建立EMCV 感染昆明小鼠模型。

［关键词］ 脑心肌炎病毒；昆明小鼠；动物模型
Establishment of Kunming mouse model of encephalomyocarditis virus （EMCV ） infection
ZHENG Jiangang ， HAO Zhili ， CAO Zhigang ， SUN Panpan ， SUN Na ， LI Hongquan. College of Veterinary Medi⁃cine ， Shanxi Agricultural University ， Taigu 030801， China
［Abstract ］ Objective ：To establish a Kunming mouse model of encephalomyocarditis virus （EMCV ） infection. Methods ：Kun‑
ming mouse aged 6~8 weeks ， half male and female ， were divided into control group and EMCV high （100 TCID 50/20 g ）， medium （10 TCID 50/20 g ） and low （1 TCID 50/20 g ） doses groups. The mice were weighed on 5 d ， 7 d ， 9 d ， 11 d ， 13 d and 15 d of EMCV infection. After blood was collected from the orbit ， the rats were sacrificed by severed neck. The organ indexes of the heart ， brain ， liver and spleen were calculated ； qRT -PCR was used to detect the viral loads in the heart ， brain ， spleen ， liver and peripheral blood ； qRT -PCR
was used to detect the expressions of IL -1β， IL -6 and TNF -α mRNA in the heart and brain ； HE staining was used to observe the patho‑logical damage of heart and brain tissues. Results ：Compared with the control group ， high dose of EMCV could significantly increase the heart index （P <0.05） and extremely significantly increase spleen index （P <0.01） when mice were infected with EMCV for 5 d ； re‑sults of qRT -PCR showed that the viral loads in the heart ， brain ， liver ， spleen and peripheral blood of mice were the highest at 9 d af‑ter high -dose EMCV infection ， and the viral loads in various organs of mice infected with medium and low doses of EMCV were very low ； when high -dose EMCV infected mice for 9 d ， the levels of IL -1β（P <0.01）， IL -6（P <0.001） and TNF -α （P <0.01） in heart and brain were significantly increased ； high -dose EMCV infection for 9 d caused infiltration of inflammatory cells and vacuolated lesions in cardiac tissues. High -dose EMCV infection for 5~9 d caused thickening of the meninges in the brain tissues ， dilation and hemorrhage
of submeningeal blood vessels ， dilation of white matter blood vessels and the formation of vascular sleeves. Conclusion ：When the EM‑CV infection dose is 0.2 ml 100 TCID 50/20 g ， the Kunming mouse model of EMCV infection is successfully established.
［Key words ］ EMCV ；Kunming mouse ；Animal model
脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus ，
EMCV ）属于小核糖核酸病毒科，心病毒属，病毒粒子外表呈光滑球形，无囊膜，为单股正链RNA 病
毒［1-3］。

EMCV 于1945年在佛罗里达州迈阿密由HELWIG 和SCHMIDT 首次从一只突然死于肺水肿和心肌炎的雄性长臂猿中分离得到，将浮肿液注射小鼠体内后，出现后肢麻痹和心肌炎等症状，随后这种病原体被命名为EMCV ［4］。

1949年后，EMCV
doi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.10.038
①本文为山西省高等学校科技创新项目（2020L0139）；山西农业大学科技创新基金项目（2020QC01）。

②同时就职于中兽医药现代化山西省重点实验室，太谷 030801。

③吉林大学动物医学学院，长春 130015。

④同时就职于山西农业大学实验动物管理中心，太谷 030801。

作者简介：郑剑纲，男，在读博士，主要从事中兽医药现代化研究， E -mail ：1349131594@ 。

通信作者及指导教师：李宏全，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中
兽医药现代化研究，E -mail ：livets@ 。

感染发生于猕猴、狒狒、狗、老虎、猕猴、蝙蝠、猪和人等不同物种，且分布于世界各地［5-11］。

EMCV感染大多数物种后症状轻微，但可引起母猪繁殖障碍、仔猪急性心肌炎，诱发仔猪猝死等［12-16］。

目前针对
EMCV感染还没有特效药和商品化疫苗。

小鼠模型具有成本低、繁殖饲养快速方便、遗传背景明确等有利因素，使其成为药物临床前评价研究等最为重要的模式动物。

EMCV小鼠模型的建立既往研究鲜见报道，主要集中于EMCV感染小鼠后临床症状和组织病理损伤的观察［17-21］。

本研究拟建立EMCV感染昆明小鼠模型，为后续EMCV致病机制和药物开发奠定基础。

1 材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　实验动物和病毒　6~8周龄SPF级昆明小鼠192只雌雄各半（质量合格证号：110011210115 155452），购自北京维通利华实验动物科技有限公司［SCXK（京）2021-0006］。

自由采食和饮水，所有动物实验符合山西农业大学动物委员会伦理要求（伦理审查号：SXAU-EAW-2021M01027）。

EMCV NJ08株由南京农业大学姜平教授惠赠，本实验室进行了扩增和保存。

根据Reed-Muench法计算其毒力为108.5 TCID50/ml［22］。

1.1.2　主要试剂　TRIzol（invitrogen，美国）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX，Biotool，美国）；反转录试剂盒（TaKaRa，中国）；苏木素染色液、伊红染色液和中性树胶（Solarbio，中国）。

1.1.3　主要仪器　烘片机、全自动轮转切片机、荧光正置显微镜（型号：HI1220、型号：RM2255、型号：DM3000，德国Leica）；生物组织包埋机（型号：KD-BM，中国科迪）；高速冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪（型号：5418、型号：D30，德国Eppendorf）；PCR 仪（型号：TC-96，美国Bio-Rad）；涡旋振荡仪（型号：GENIUS3，德国IKA）；荧光定量PCR仪（型号：7500，美国Applied Biosystems）。

1.2　方法　
1.2.1　实验分组及给药　小鼠适应性饲养1周后，分为正常组和EMCV高、中、低剂量感染组。

EMCV 高剂量组小鼠腹腔注射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV，中剂量组小鼠腹腔注射0.2 ml 10 TCID50/ 20 g EMCV，低剂量组小鼠腹腔注射0.2 ml 1 TCID50/ 20 g EMCV，空白组腹腔注射等体积的生理盐水。

每天观察小鼠临床症状。

于EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d，每组随机选取8只，经摘取眼球采血，脱颈处死小鼠，收集不同脏器进行后续检测。

1.2.2　检测各组小鼠心脏、脑、脾脏和肝脏指数　摘取心脏、脑、脾脏和肝脏后，用滤纸吸干残留血后，并依据下列公式计算脏器指数。

脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠质量(g)×10。

1.2.3　qRT-PCR检测病毒载量和炎症因子　用TRIzol法提取小鼠血液、心脏、脑、脾脏和肝的总RNA，用核酸蛋白浓度测定仪检测RNA的浓度和纯度，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。

qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d时血液、心脏、脑、脾脏和肝的病毒载量。

使用本实验室保存的1.59× 108 Copies/µl EMCV 3D重组质粒为模板，10倍比稀释，加入3D基因正反向引物进行扩增。

标准曲线由各稀释度模板的起始拷贝数及其对应的Ct值构成。

依据标准曲线，检测每ml样品中EMCV 3D拷贝数。

EMCV 3D基因引物序列为F：5'-TTAGGGCGGGTTT‑GTAT-3'，R：5'-TTTGTTAGCGGGAGTTA-3'。

相对qRT-PCR检测9 d时心和脑IL-1β、IL-6和TNF-α的相对表达量。

IL-1β F：5'-GCCACCTTTTGACAGT‑GATGAGA-3'，R：5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3'；IL-6 F：5'-GTCCTTCCTACCCCAATTTCCA-3'，R：5'-TAACGCACTAGGTTTGCCGA-3'；TNF-α F：5'-G-ATCGGTCCCCTTTGGGATG-3'，R：5'-GGTTTGCTA-CGCAGTGGGC-3'；β-Actin F：5'-CTGAGCTGCGTTT‑TACACCC-3'，R：5'-CGCCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.2.4　组织病理切片　取小鼠心尖和左脑，于10%甲醛溶液中固定24 h。

经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、烘片、脱蜡、苏木素-伊红染色和中性树胶封片后，镜检观察心脏和脑组织病理变化。

1.3　统计学处理　所有数据均以xˉ±s表示。

使用GraphPad Prism TM5.0软件中单因素方差分析法（one-way ANOVA）进行多组间差异性分析。

P< 0.05，表示差异具有统计学意义。

2 结果
2.1　临床症状观察　与空白组相比，昆明小鼠经腹腔接种0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV后第3 d开始出现精神沉郁、被毛粗乱等症状；感染5~11 d不断有小鼠出现震颤、弓背及后肢瘫痪等症状，后肢瘫痪症状出现24~48 h后小鼠出现死亡，至实验结束，高剂量组共出现死亡小鼠7只。

其他未出现症
状的小鼠感染15 d与空白组相比均未出现异常，但在组织中能检测到EMCV病毒的复制。

中剂量和低剂量组小鼠直到第15天未出现异常症状。

2.2　不同剂量EMCV在不同时间点对小鼠脏器指数的影响　由图1可知，与空白组相比，高剂量
EMCV感染小鼠5 d时，能显著提高心脏指数（P< 0.05），极显著提高脾脏指数（P<0.01），对于脑和肝脏指数并无显著影响。

在7 d、9 d、11 d、13 d和15 d 时，不同剂量的EMCV感染对于小鼠的脏器指数无显著影响（P>0.05），表明在EMCV感染小鼠前期造成心脏和脾脏肿大。

2.3　不同剂量EMCV感染小鼠在不同时间点的病毒载量　利用qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染的昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d时，心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV载量，结果见图2。

高剂量EMCV感染昆明小鼠，随着时间增加，在心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV载量逐渐增加，在9 d时达到顶峰，然后随着时间增加病毒载量逐渐下降，其中脑组织的病毒载量最高。

与高剂量组相比，中剂量和低剂量EMCV感染小鼠不同时间点后，心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV载量很低，且部分低剂量EMCV感染小鼠未能检测到EMCV 的复制情况。

2.4　不同剂量EMCV感染小鼠9 d时炎症因子mRNA表达　利用qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染昆明小鼠9 d时，心脏和脑中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达情况，结果见图3。

与空白组相比，高剂量EMCV感染9 d时，能极显著提高心脏中IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.001）和TNF-α（P< 0.01） mRNA表达，中剂量EMCV感染9 d
时则显著
Note：Compared with Control group， *.P<0.05，**.P<0.01.
图1　不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d时
各组脏器指数比较
Fig.1　Comparison of organ indexes in each group infected
with different doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d，
13 d and 15 d
图2　qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、
11 d、13 d和15 d时心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中
EMCV载量
Fig.2　qRT-PCR was used to detect EMCV loads in differ⁃
ent organs and peripheral blood infected with dif⁃
ferent doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d， 13 d
and 15 d
Note：Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<
0.001.
图3　qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染9 d时心脏和脑
IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量
Fig.3　qRT-PCR detected relative expressions of IL-1β，
IL-6 and TNF-α mRNA in heart and brain infected
with different doses of EMCV for 9 d
提升心脏中IL -1β mRNA 表达（P <0.05）。

与空白对照组相比，高剂量EMCV 感染9 d 时能极显著提高脑组织中IL -1β和TNF -α mRNA 表达（P <0.001），显著增加IL -6 mRNA 表达（P <0.05）。

中剂量EMCV 感染9 d 时能极显著提高脑组织中TNF -α mRNA 的表达 （P <0.01）。

与空白组相比，低剂量EMCV 感染对心脏和脑组织中IL -1β、IL -6和TNF -α mRNA 表达无显著影响（P >0.05）。

2.5　小鼠心脏组织病理损伤情况　不同剂量 EMCV 感染昆明小鼠5 d 、7 d 、9 d 、11 d 、13 d 和15 d 时，对心脏组织进行HE 染色。

由图4可知，空白组心肌细胞纤维清晰可见，心肌纤维平行排列，且整齐均匀。

胞浆染色均匀，细胞核呈椭圆形，位于细胞中部。

与空白组相比，高剂量EMCV 感染5 d 时心脏组织炎症细胞增多；7 d 时心脏组织有大面积炎症细胞浸润；9 d 时心肌细胞出现空泡状病变；11 d 时炎症细胞浸润减少，空泡状病变消失，心肌间隙增
宽，后期回归正常。

中剂量EMCV 仅在感染前期导致少量炎症细胞浸润和心肌间隙增宽。

低剂量 EMCV 感染与空白组形态基本一致。

2.6　小鼠脑组织病理损伤情况　空白组大脑脑膜正常，皮质结构清晰，白质无炎症细胞浸润。

与空白组相比，高剂量EMCV 感染5 d 时，脑膜下血管扩张，7 d 和9 d 时脑膜增厚，膜下出血，后期脑膜恢复正常，膜下出血逐渐吸收；中剂量EMCV 感染7 d 时，
脑膜增厚和脑水肿，9 d 时白质有出血点，中剂量感染其他时间点和低剂量感染与空白组形态基本一致（图5）。

与空白组相比，高剂量EMCV 感染5 d 时，脑白质出现炎症细胞浸润，7 d 和9 d 时，白质内血管高度扩张，炎症细胞浸润，形成血管套，后期逐渐恢复正常；中剂量EMCV 感染前期，出现轻微的炎症细胞浸润和血管扩张，后期逐渐恢复正常。

低剂量感染与空白组形态基本一致（图6）。

3 讨论
目前，大量研究集中于EMCV 感染小鼠临床症状的观察，而系统建立EMCV 感染昆明小鼠模型鲜见报道，这在一定程度上限制了抗EMCV 临床药物的开发。

本实验室前期研究发现莪术醇体外能够显著抑制EMCV 的复制，为了验证其体内抗病毒活
性，首先需建立EMCV 感染昆明小鼠模型［23］。

EMCV
感染昆明小鼠模型的建立为抗EMCV 药物的开发奠定了基础。

首先采用100 TCID 50/20 g 的EMCV 感染小鼠5 d
时，能够显著提高心脏和脾脏指数。

施开创等［19］使用103.67 TCID 50的EMCV GXLC 株腹腔注射小鼠，结果发现心脏重量与体质量的比值在3~14 d 都会保
持明显升高。

本实验仅在感染5 d 时显著升高，
这
图4　不同剂量EMCV 感染5 d 、7 d 、9 d 、11 d 、13 d 和15 d 时
心脏组织病理学切片（HE 染色，×200）
Fig.4　Histopathological sections of heart tissue infected
with different doses of EMCV on 5 d ，7 d ，9 d ，11 d ， 13 d and 15 d （HE staining ， ×200
）
图5　不同剂量EMCV 感染5 d 、7 d 、9 d 、11 d 、13 d 和15 d 时
脑皮质和脑膜组织病理学切片（HE 染色，×200）Fig.5　Histopathological sections of cerebral cortex and
meninges infected with different doses of EMCV on 5 d ， 7 d ， 9 d ， 11 d ， 13 d and 15 d （HE staining ， ×200
）
图6　不同剂量EMCV 感染5 d 、7 d 、9 d 、11 d 、13 d 和15 d 时
脑白质组织病理学切片（HE 染色，×200）
Fig.6　Histopathological sections of cerebral white matter
infected with different doses of EMCV on 5 d ， 7 d ， 9 d ， 11 d ， 13 d and 15 d （HE staining ， ×200）
可能取决于选取相对较低的剂量和不同的毒株。

EMCV感染首先在位于扁桃体的巨噬细胞复制，然后随着游走的巨噬细胞遍布全身［24］。

脾脏红髓中存在大量平滑肌细胞和纤维，外周围绕脾索巨噬细胞，EMCV在巨噬细胞中复制后，造成该类细胞脱离消失，而平滑肌细胞直接与血液中的凝血因子接触，使血小板激活聚集，激发凝血系统，使红细胞在脾脏中聚集，充血肿大。

本实验中，采用100 TCID50/20 g EMCV感染昆明小鼠，随着时间增加，心脏、脑和脾脏中的EMCV 载量逐渐增加，在9 d时达到顶峰，然后随着时间增加病毒载量逐渐下降。

殷雪婷［21］研究发现EMCV HLJ感染小鼠后，在组织器官中广泛分布，各器官都能检测到病毒的存在，其中心和脑病毒载量最高。

本实验结果表明，100 TCID50/20 g的EMCV感染可以导致病毒在小鼠体内大量复制。

心脏和脑是EMCV感染的靶器官，可以导致心肌炎和脑炎，最终导致心力衰竭和瘫痪。

炎症因子被认为在心脏衰竭的发病过程中具有非常重要的作用，IL-1β降低心脏收缩力，IL-6导致负性肌力，TNF-α引起心肌收缩障碍、心肌炎、心室扩张和心脏发育不全［25-27］。

研究表明，致心肌炎型EMCV-M感染小鼠后，心肌中IL-1β、TNF-α表达与心肌病变程度呈正相关［19］。

施开创等［19］研究还表明EMCV GXLC感染小鼠后，脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达显著上升。

本研究结果显示，与空白对照组相比，100 TCID50/20 g EMCV感染9 d时，能极显著提升心脏和脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表达，表明100 TCID50/20 g EMCV感染小鼠造成了靶器官心和脑的炎症反应。

EMCV感染小鼠诱发的心肌炎特点为心肌坏死和炎症细胞浸润，并且导致心力衰竭和扩张型心肌病［28］。

研究发现EMCV复制主要位于大脑海马体和小脑颗粒层的小区域坏死性病灶内［29］。

从胸椎到腰椎脊髓，控制骨骼肌活动和张力的运动神经元也会受到影响，从而导致瘫痪［30］。

病理学组织切片结果显示，100 TCID50/20 g EMCV感染能够引起小鼠心脏组织大面积炎症细胞浸润和空泡化病变。

也引起脑组织脑膜下血管扩张、脑膜增厚、膜下出血、脑白质炎症细胞浸润和形成血管套的病理变化。

结果表明100 TCID50/20 g EMCV感染小鼠造成了靶器官心和脑的病理损伤。

综上所述，腹腔注射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV可引起小鼠发病，成功建立了EMCV感染昆明小鼠模型。

本实验通过测定不同时间点EMCV感染小鼠的不同脏器中病毒RNA，并观察了心和脑组织病理学改变，了解EMCV进入小鼠引起的变化。

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［收稿 2022‑06‑07 修回 2022‑08‑22］
（编辑苗磊）
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