烟草内生真菌Penicillium_janthinellum的代谢表型分析

烟草内生真菌Penicillium janthinellum的代谢表型分析马骏1王霞2黄鸿3郭亚利1罗杰1孙智荣1王茂胜2高贵1*
（1贵州省烟草公司黔西南州公司，贵州兴义562400；
2贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州贵阳550003；
3瓮福（集团）有限责任公司中低品位磷矿及其共伴生资源高效利用国家重点实验室/瓮福技术研究院，
贵州贵阳550016）
摘要为了研究烟草内生真菌Penicillium janthinellum的代谢表型特征，本文利用Biolog细胞表型芯片技术，对烟草内生真菌的950种代谢表型进行了测定。

结果表明：烟草内生真菌能够代谢101种碳源、304种氮源、8种磷源和1种硫源；能在10%氯化钠、6%氯化钾、5%硫酸钠、20%乙二醇、6%甲酸钠、7%尿素、12%乳酸钠、200mmol/L磷酸钠、100mmol/L硝酸钠、100mmol/L硫酸铵中较好生长；其适应的pH值范围为5~10；当pH值为5.2时，在20~200mmol/L苯甲酸钠中无法生存。

关键词烟草；内生真菌；Penicillium janthinellum；代谢表型；细胞表型芯片技术
中图分类号S182文献标识码A
文章编号1007-5739（2023）18-0116-05
DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.18.029开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Metabolic Phenotype Analysis of Endophytic Fungus Penicillium janthinellum in Tobacco MA Jun1WANG Xia2HUANG Hong3GUO Yali1LUO Jie1SUN Zhirong1WANG Maosheng2GAO Gui1* (1Qianxinan Monopoly Bureau of Guizhou Tobacco Company,Xingyi Guizhou562400;
2College of Food Pharmaceutical Engineering,Guizhou Institute of Technology,Guiyang Guizhou550003;
3State Key Laboratory of Efficient Utilization for Low Grade Phosphate Rock and Its Associated Resources,Wengfu (Group)Co.,Ltd./Wengfu Technical Research Institute,Guiyang Guizhou550016) Abstract In order to study the metabolic phenotypes of tobacco endophytic fungus Penicillium janthinellum, 950metabolic phenotypes of tobacco endophytic fungus were determined by using Biolog cell phenotype chip technology. The results showed that the endophytic fungus could metabolize101carbon sources,304nitrogen sources,8phosphorus sources and1sulfur source;it could grow well in10%sodium chloride,6%potassium chloride,5%sodium sulfate, 20%ethylene glycol,6%sodium formate,7%urea,12%sodium lactate,200mmol/L sodium phosphate,100mmol/L sodium nitrate,and100mmol/L ammonium sulfate;its adapted pH value range was from5to10;when the pH value was5.2,it could't survive in20-200mmol/L sodium benzoate.
Keywords tobacco;endophytic fungus;metabolic phenotype;cell phenotype chip technology
烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物之一，也是贵州省财政收入和农民致富的主要经济来源[1]。

由于土壤、气温和栽培制度的原因，烟叶土传病害严重发生，导致烟叶质量下降，烟农收入减少[2]。

1866年德国植物学家De Bary最先提出植物内生菌（endophyte），认为内生菌是一个十分丰富的微生物类群，与植物健康组织共生并与植物协同进化[3-4]。

关于植物内生菌研究的报道很多，王建锋等[5]研究发现，有些药用植物内生真菌可以产生抗恶性肿瘤药物紫杉醇，拓宽了紫杉醇药源；张玲琪等[6]研究美登木（May-tenus hookeri）内生真菌，筛选出抗癌物质球毛壳甲素，为抗癌药物研制提供了新的思路；陈泽斌从烟草组织
基金项目贵州省烟草公司黔西南州公司项目（201903，201707，201804）；贵州理工学院项目（XJGC20190638，XJGC 20190639）。

第一作者马骏（1982—），男，硕士，农艺师。

研究方向：资源微生物的研究和应用。

E-mail：****************
*通信作者
收稿日期2022-12-08
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内分离出拮抗黑胫病菌的解淀粉芽孢杆菌，为生物防治提供了一种途径。

类似的报道还有很多，但不同菌株作用效果不同[7]。

另外，有些植物内生菌还能够产生广谱的抗虫代谢产物[8]。

微生物的培养基对微生物的生物学特性影响很大，培养内生菌时，根据其特殊的营养需求设计培养基，促进微生物的生长，才能使其在混合菌样中由劣势变为优势[9]，从而发挥作用，这就涉及微生物在不同碳源、氮源、磷源、硫源、生物代谢途径等环境下的细胞代谢表型分析。

传统方法测定微生物代谢表型，效率低、误差大[10]。

2000年Bochner 等[11]发明了Biolog细胞表型芯片技术（PMs），该技术可以同时测定1000种微生物代谢表型，被广泛应用到微生物C、N、P、S等基质条件下细胞表型的测试。

本文对烟草内生真菌Penicillium janthinellum进行表型芯片技术（PMs）测试，分析其营养和代谢表型，旨在为发挥烟草内生菌的生物学功能奠定理论基础。

1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
内生真菌菌株P.janthinellum，能够拮抗烟草黑胫病病原菌，由贵州省烟草科学研究院分离、鉴定和保存。

1.1.2供试培养基与试剂
菌株培养使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min。

代谢板PM1~10、GEN III板、IF-10b GN/GP（# 72266）、接种液IF-0a GN/GP（#72268）和染料Mix F（# 74226）、Mix G（#74227）和Mix H（#74228），均购自美国Biolog公司。

1.2代谢表型分析
参照Wang等[12]的方法并加以改进。

使用PM系统，设置950种不同的生长条件，包括190种碳源、95种氮源、59种磷源、35种硫源、94种生物合成途径、285种氮途径和192种对不同渗透性和酸碱条件的耐受性。

PM板中，PM1~2为碳源，PM3、6~8为氮源，PM4为磷源和硫源，PM5为生物合成途径，PM9用于测试渗透/离子，PM10用于pH效应。

将供试内生真菌菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中28℃黑暗培养7d。

首先，用无菌蒸馏水将分生孢子洗下制成孢子悬浮液（1×105个/mL），再用无菌FF-IF接种液调制成悬浮液，透光率为62%T（T为Biolog标准浓度单位），然后将100μL细胞悬浮液添加到PM板的每个孔中孵育。

FF-IF用于PM板1、2。

FF-IF+100mmol/L D-葡萄糖+5mmol/L磷酸钾（pH值6.0）+2mmol/L硫酸钠用于PM板3、5、6、7、8。

FF-IF+100mmol/L D-葡萄糖用于PM板4。

100mmol/L D-葡萄糖用于PM板9、10。

平板在28℃的OmniLog中孵育7d，每15min 读取一次数据。

1.3数据处理与分析
通过捕获微阵列的数字图像并将浊度值存储在显示为动力学图的计算机文件中，在OmniLog站中进行孵育和表型数据记录。

数据分析使用动力学和参数化软件（Biolog OL-FM-1.2.exe），根据染料形成动力学曲线下的面积确定表型。

2结果与分析
使用PM系统，表型组学分析共获得内生真菌P. janthinellum的950种代谢表型信息。

其中，碳源表型190种，氮源表型380种（95种氮源和285种氮途径），磷源表型59种，硫源表型35种，生物合成途径代谢表型94种，对不同渗透性和酸碱条件的耐受性192种（图1）。

当动力学曲线下面积>阴性对照，则认为菌株能够代谢该物质，利用该物质进行生长；当动力学曲线下面积≥阴性对照的1.5倍，则认为该物质能够明显促进内生真菌P.janthinellum生长。

在测定的190种碳源中，内生真菌能够代谢101种，占53.16%。

其中，有67种能够明显促进该菌株P.janthinellum的生长（表1），占35.26%，包括L-来苏糖（PM1，H06）、L-阿拉伯糖（PM1，A02）、D-核糖（PM1，C04）及D-蜜二糖（PM1，C11）等。

在测定的380种氮源中，内生真菌P.janthinellum 能够代谢304种，占80%，包括78种氨基酸氮源（占20.53%）与226种肽类氮源（占59.47%）。

其中，197种能够明显促进该菌株的生长（表2），占总氮源的51.84%，包括胍丁胺（PM3，D12）、L-色氨酸（PM3，B12）、L-谷氨酰胺（PM3，B01）。

在测定的59种磷源中，内生真菌P.janthinellum 能够代谢8种，占13.56%，包括3-磷酸腺苷（PM4，A09）、5-磷酸腺苷（PM4，A10）、3，5-环磷酸腺苷（PM 4，A12）和3，5-环磷酸胞苷（PM4，C12）等。

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在测定的35种硫源中，内生真菌P.janthinellum 仅能代谢1种，占2.86%，即环丁砜（PM 4，H12）。

由图1可知，内生真菌P.janthinellum 对渗透压的忍受能力较强，在1%~10%氯化钠中长势良好，在3%~6%氯化钾、2%~5%硫酸钠、5%~20%乙二醇、
1%~6%甲酸钠、2%~7%尿素、1%~12%乳酸钠、20~
200mmol/L 磷酸钠、10~100mmol/L 硝酸钠和10~100mmol/L 硫酸铵中均能较好生长。

适应的pH 值范
围为5~10，当pH 值为7时，该菌株在20~200mmol/L 的苯甲酸钠中生长良好；但当pH 值为5.2时，在20~200mmol/L 的苯甲酸钠中无法生存（PM 9，G05~G08）。

在10~100mmol/L 亚硝酸钠中都能生长，但在图1内生真菌P.janthinellum 表型指纹图
谱
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100mmol/L亚硝酸钠中代谢降低（PM9，H12）。

3结论与讨论
分析结果表明，烟草内生真菌P.janthinellum能够代谢190种碳源中的101种，其中有67种能够明显促进该菌株的生长；380种氮源中，内生真菌P.jan-thinellum能够代谢304种氮源，其中197种能够明显
表1PM1和PM2代谢板中明显促进内生真菌P.janthinellum生长的碳源
孔1-A02 1-A03 1-A06 1-A08 1-A09 1-A10 1-A11 1-A12 1-B02 1-B03 1-B06 1-B08 1-B11 1-B12 1-C04 1-C06 1-C07 1-C08 1-C09 1-C10 1-C11 1-C12
底物
L-阿拉伯糖
N-乙酰-D-氨基葡萄糖
D-半乳糖
脯氨酸
D-丙氨酸
海藻糖
D-甘露糖
己六醇
D-山梨醇
甘油
D-葡糖酸
D-木糖
D-甘露醇
L-谷氨酸
D-核糖
L-鼠李糖
D-果糖
乙酸
α-D-葡萄糖
麦芽糖
D-蜜二糖
胸苷
孔
1-D01
1-D05
1-D11
1-D12
1-E01
1-E05
1-E08
1-E09
1-E10
1-E12
1-F01
1-F03
1-F08
1-F11
1-F12
1-G01
1-G04
1-G05
1-G06
1-G10
1-G11
1-G12
底物
L-天门冬酰胺
吐温40
蔗糖
尿苷
L-谷氨酰胺
吐温80
β-甲基-D-葡糖苷
核糖醇
麦芽三糖
腺苷
甘氨基天冬氨酸
肌糖纤维醇
粘叶酸
纤维二糖
肌苷
甘氨酰-L-谷氨酸
L-苏氨酸
L-丙氨酸
L-丙氨酰胺-甘氨酸
丙酮酸甲酯
D-苹果酸
L-苹果酸
孔
1-H01
1-H02
1-H03
1-H04
1-H06
1-H08
1-H09
1-H10
1-H11
1-H12
2-A04
2-A05
2-A06
2-A12
2-B04
2-B08
2-C01
2-C12
2-D01
2-D07
2-E02
2-F06
2-H09
底物
氨乙酰-L-脯氨酸
对羟基苯乙酸
邻羟基苯乙酸
酪胺
L-来苏糖
丙酮酸
L-半乳糖醛酸-γ-内酯
D-半乳糖醛酸
苯乙胺
2-氨基乙醇
β-环糊精
γ-环糊精
糊精
果胶
苦杏苷
熊果苷
龙胆二糖
异麦芽酮糖
D-棉籽糖
松二糖
己酸
奎尼酸
二羟丙酮
注：表中所列碳源为动力学曲线下面积≥阴性对照的1.5倍的碳源类物质。

表2PM3代谢板中明显促进内生真菌P.janthinellum生长的氮源
孔3-A02 3-A03 3-A04 3-A05 3-A07 3-A08 3-A09 3-A10 3-A11 3-A12 3-B01 3-B02 3-B04 3-B05 3-B06 3-B07 3-B08 3-B09 3-B10 3-B11 3-B12
底物
氨
亚硝酸盐
尿素
硝酸盐
L-丙氨酸
L-精氨酸
L-天冬酰胺
L-天冬氨酸
L-半胱氨酸
L-谷氨酸
L-谷氨酰胺
甘氨酸
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
L-赖氨酸
L-甲硫氨酸
L-苯丙氨酸
L-脯氨酸
L-丝氨酸
L-苏氨酸
L-色氨酸
孔
3-C01
3-C02
3-C03
3-C06
3-C09
3-C10
3-C11
3-C12
3-D03
3-D05
3-D09
3-D11
3-D12
3-E01
3-E02
3-E03
3-E11
3-F01
3-F02
3-F03
3-F06
底物
L-酪氨酸
L-缬氨酸
D-丙氨酸
D-谷氨酸
D-缬氨酸
L-瓜氨酸
L-高丝氨酸
L-鸟氨酸
L-焦谷氨酸
甲胺
乙醇胺
腐胺
胍丁胺
组胺
β-苯乙胺
酪胺
N-乙酰-D-氨基葡萄糖
N-乙酰-D-甘露糖胺
腺嘌呤
腺苷
鸟嘌呤
孔
3-F07
3-F12
3-G01
3-G02
3-G05
3-G07
3-G08
3-G09
3-G12
3-H01
3-H02
3-H03
3-H04
3-H05
3-H06
3-H07
3-H08
3-H09
3-H10
3-H11
3-H12
底物
鸟苷
肌苷
黄嘌呤
黄苷
尿囊素
D，L-α-氨基丁酸
γ-氨基丁酸
ε-氨基N-己酸
α-氨基戊酸
丙氨酸-天冬氨酸
丙氨酸-谷氨酰胺
丙氨酸-谷氨酸
丙氨酸-甘氨酸
丙氨酸-组氨酸
丙氨酸-亮氨酸
丙氨酸-苏氨酸
甘氨酸-天冬酰胺
甘氨酸-谷氨酰胺
甘氨酸-谷氨酸
甘氨酸-甲硫氨酸
甲硫氨酸-丙氨酸
注：表中所列氮源是动力学曲线下面积≥阴性对照的1.5倍的氮源物质。

119
促进该菌株的生长；59种磷源中，内生真菌P.janthi-nellum能够代谢8种；35种硫源中，内生真菌P.jan-thinellum能够代谢1种。

内生真菌P.janthinellum对渗透压的忍受能力较
强，在1%~10%氯化钠中长势良好，在3%~6%氯化
钾、2%~5%硫酸钠、5%~20%乙二醇、1%~6%甲酸
钠、2%~7%尿素、1%~12%乳酸钠、20~200mmol/L磷
酸钠、10~100mmol/L硝酸钠、10~100mmol/L硫酸铵
中均能较好生长。

其适应的pH值范围为5~10，当pH值为7时，该菌株在20~200mmol/L的苯甲酸钠中生长良好；但当pH值为5.2时，在20~200mmol/L的
苯甲酸钠中无法生存。

在10~100mmol/L亚硝酸钠
中都能生长，但在100mmol/L亚硝酸钠中代谢降低。

关于烟草内生真菌研究的报道主要包括微紫青
霉（Penicillium janthinellum）、尖胞镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht.）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、变黑轮枝菌（Verticil-lium nigrescens）、棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）、腐皮链孢（Fusarium solani）、灰白翅孢壳（Emericellop-sis pallida）、帚枝霉属真菌（Sarocladium kiliense）、交链孢属（Alternaria sp.）、共生节菱孢菌（Arthrinium arun-dinis）、高山被孢霉（Mortierella alpina）、毁丝霉（Myceli-ophthora）、淡紫拟青霉[Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson]、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）等。

一种微生物能够变为优势菌群，关键是它对环境的适应性，评价的指标就是表型变化[13]。

Biolog表型芯片技术是一种速度快、高通量、准确性高、能动态反映微生物细胞代谢功能的技术，已经广泛应用于微生物鉴定、营养和代谢研究领域[14-16]。

汤桂容等[17]研究表明，不同养分配合对土壤细菌、真菌和放线菌群落有调节作用，不同微生物对养分的需求不同。

本试验中，内生真菌P.janthinellum能够代谢53.16%的碳源，80%的氮源，13.56%的磷源及2.86%的硫源，与Wang等[18]对黑胫病菌的代谢表型也有差异。

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