一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定

一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的
筛选和鉴定
第24卷第1O期
2011年10月
环境科学研究
ResearchofEnvironmentalSciences
V o1.24,No.10
Oct.,2011
一
株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定
曾琳,朱琼芳,卢贯能,陈来琳,匡庐峰,柯林
华南理工大学环境科学与工程学院,广东广州510006
摘要:利用含As"肉汤培养基,从广西河池砷污染地区水样和沉积物样中通过多次分离,纯化获取砷耐受菌.进一步从砷
耐受菌中筛选出在好氧条件下可以同时进行砷氧化和反硝化的多功能菌株c1l一35.对该菌株进行形态观察,并利用16S
rDNA序列分析方法进行鉴定,发现该菌株为革兰氏阴性菌,与Achromobacterdenitrificallsstrain22426和Achromobacter xylosoxidansstrainC8B的同源性均达99%;该菌株在NO一和As"同时存在的条件下好氧反硝化能力和砷氧化速率均得
到提高;在只含NO一的条件下,NO,一的去除率为53.65%,而在As"和NO,一同时存在的条件下,NO一的去除率为
75.27%.在不含NO一和含NO一的条件下,As"的转化率都在99%以上,而在含NO 一的条件下,As"的氧化速率更快.
这种相互促进可能与反硝化过程中的电子传递和砷氧化过程中的动态平衡有关. 关键词:砷氧化;好氧反硝化;多功能菌
中图分类号:X172文献标志码:A文章编号:1001—6929(2011)10—1123—06
ScreeningandIdentificationofanAchromobacterStrainforBothArsenic OxidizingandDenitrifyingAbilities
ZENGLin,ZHUQiong-fang,LUGuan—neng,CHENLai—lin,KUANGLu-feng,KELin CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou510006,China
Abstract:Waterandsedimentsamplesweretakenfromanarsenic—contaminatedregioninHechi,GuangxiProvince.Arsenite—resistingstrainswereisolatedandpurifiedseveraltimesfrombrothmediumcontainingAs.cll 35.thearseniteoxidizerand aerobicdenitrifierwasfurtherscreenedfromarsenite—resistingstrains.Morphologicalstudiesand16SrDNAsequencingrevealedthat theisolatewasGramnegative.andhad99%homogeneitytoAchromobacterdenitrific
口,lsstrain22426andAchromobacter
xylosoxidansstrainC8B.Theaerobicdenitrifyingandarsenite?oxidizingabilityofthisstrai nwasenhancedwhenarseniteandnitrate
werepresenttogether.Theremovalrateofnitratewas53.65%whenonlynitratewaspresent,w hiletheremovalrateincreasedto
75,27%whenbotharseniteandnitratewerepresent.TheconversionrateofAs"wasabove99 %withandwithoutnitrate
,
andthe
oxidationratewasenhancedbythepresenceofnitrate.Thisphenomenonmayberelatedtothe electrontransmissionprocessof aerobicdenitrifieationandthedynamicbalanceinthearseniteoxidation.
Keywords:arsenicoxidation;aerobicdenitrification;multi—functionbacteria
砷是一种致癌物质,长期饮用高砷水会导致
慢性砷中毒和癌症等疾病.自然界中,砷以4
种氧化价态存在:As,As,As¨和As",其中元素
砷很少存在.As"的毒性最强,是As的25～60
收稿日期:2011—03—15修订13期:2011—04—19
基金项目:国家自然科学基金项目(21047003);教育部留学回国人员科研启动基金项目(x2hjB7100180)
作者简介:曾琳(1986一),女,江西吉安人,******************.责任作者,柯林(1973一),男,广西梧州人,教授,博士,主要从事环境微生物研究,**************.cn
倍..环境水体中的NO,一和NO:一被人体摄人
后,可转化为亚硝胺,是一种致突变,致畸,致癌
物,对人体是潜在的健康威胁.各国对饮用水
中NO一含量已有比较严格的规定.
含砷废水主要在冶金,化工和农药生产使用
过程中产生;含氮废水主要来自生化污水,工业废
水和农业地表径流;而有些农药废水中砷和氮
含量都比较高,钨冶炼过程中也会产生含砷和氨
氮的废水.另外,如风化,侵蚀等自然作用可使
砷从地壳中释放出来,进入到自然水体或地下水,
环境科学研究第24卷
与水中原本存在的氮形成As¨和NO一共同污染
的状况.而环境中本身可能存在Fe/Mn氧化物和
硫酸盐等物质,加上微生物的作用,可能导致砷的
毒性和迁移性增强,对公共健康造成威胁".
目前国内外对于含砷废水的处理方法有吸附
法,离子交换法,化学沉淀法和生物法等,而对
于含氮废水的脱氮主要通过吹脱法,离子交换法
和活性污泥法等¨.其中,化学沉淀法会产生含砷
废渣,吹脱法产生的氨废气会造成环境的二次污
染;吸附法处理效率低,离子交换法存在费用高的
问题.而生物处理则是一种廉价,高效,污染较
小的处理方法,符合可持续发展的需要.目前国内
外对于含砷含氨氮废水处理的研究极少,采用石
灰一亚铁盐除砷,湿式催化氧化吹脱除氮联合工
艺来实现对钨冶炼过程产生的废水的有效治理是
国内对含砷含氨氮废水实施系统处理的先例.
而鲜见关于含氨氮或NO,一的砷废水的生物法处
理的研究报道,大大限制了对氮砷联合污染的治理.采用活性污泥法去除NO一的有效性取决于反硝化菌的耐砷能力¨.而共存污染物的存在,使
得针对单一污染物开发的污染去除工艺或方法
在实际应用中通常无法取得预期效果,因此有必
要研究可以同时去除多种共存污染物的去除手
段.有学者¨对水体中微生物的厌氧砷氧化和
厌氧反硝化之间的联系做过研究,而对于好氧反
硝化菌的报道并不多.该研究从砷污染区筛选出
能够同时在好氧条件下进行砷氧化和反硝化的
多功能菌株,初步探究该菌株砷氧化和好氧反硝
化机理及其相互作用机制,使利用微生物来同时
进行脱氮除砷的目标得以实现,以突破该领域的
研究瓶颈.
1材料与方法
1.1菌株来源
从广西河池砷污染地区采回水样和沉积物样
中,筛选分离出同时具有砷氧化和反硝化功能的
多功能菌株c11-35.
1.2材料
肉汤培养基:筛选分离及菌株活化时使用.
Minimal培养基(g/L):NH4C1,0.67;K2HPO4,
O.61;KH2PO4,0.75;FeC13,0.0024;MgSO4?7H2O,0.2; CaC12,0.023;MnC12?4H2O,0.003;Na2MoO4?2H2O, 0.001;NaC6H5O7?2H2O,3.64.
100mmol/LAs"储备液.
1.3方法
1.3.1菌株的筛选分离
将0.5mL水样接种至c(As")为5和1O
mmol/L的肉汤培养基的试管中培养;将沉积物样
稀释100倍接种至C(As")分别为5和10mmol/L
的肉汤培养基的试管中培养.再通过划线分离,得
到纯化后的砷耐受菌.将砷耐受菌株经肉汤培养
基活化24h后,按1%的接种量接种至c(NO一)
为10mmol/L的Minimal培养基中(pH8.7,30℃)
进行反硝化菌的定性筛选.首先通过格利斯试剂
法定性判断培养基中是否含有NO一,若不存
在,则认为该菌株有反硝化功能;若NO,一存在,则
利用二苯胺试剂法检测是否存在NO:一,若存
在,则表示该菌株具有反硝化功能.另一方面,将
砷耐受菌株经肉汤培养基活化24h后,按I%的
接种量接种至c(As")为1mmol/L的Minimal培养
基中(pH8.7,30℃),高锰酸钾法¨变红即表示
该菌株具有砷氧化功能.
1.3.2菌株的形态学特征
对筛选得到的菌株进行划线分离,观察菌落
生长情况,并进行革兰氏染色,镜检观察.
1.3.316SrDNA序列测定及系统发育分析
采用DNA提取试剂盒(北京普博欣)提取
DNA,以DNA为模板进行PCR扩增,扩增引物为
通用引物(正向引物27F:5一AGAGTTTGA TCM TGGCTCAG一3,反向弓I物1492R:5一TACGGYT ACCTTGTTACGACTT一3,由上海英骏生物技术有限公司合成).PCR反应参数:94℃预变性3min;
94℃变性40S,54℃退火50S,72℃延伸2min,
35个循环;72oC延伸10min.通过琼脂糖凝胶电
泳检验.PCR产物的纯化与测序由华大基因公司
完成.用BLAST数据库进行对比鉴定.
1.3.4菌株反硝化功能与砷氧化功能的测定
将菌株cll一35肉汤培养基中活化24h,并统一
OD值为0.015,然后按1%的接种量分别接种至
c(NO一)为10mmol/L的Minimal培养基(NM),
C(As)为1mmol/L的Minimal培养基(AM)以及
c(NO一)为10mmol/L同时c(As")为1mmol/L的
第l0期曾琳等:一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定1125 Minimal培养基(NAM)中.培养条件为:pH8.7,
150r/min,30℃摇床培养.分别测定不同时间
OD..值及c(NO,一),c(NO2一),c(As")和
c(As).
1.3.5分析方法
C(NO一)采用酚二磺酸紫外分光光度法测
定;c(NO,一)采用N一(1一萘基)一乙二胺光度法
测定,紫外可见光光度计uV3000(Shimadzu,
Japan);C(As")与c(As")采用高效液相色谱法
(HPLC)测定,UItiMate3000(Dionex);HPLC反应
条件为10%甲醇冲洗高效液相柱,流速0.5
mL/min;流动相为3.6g/L磷酸二氢钠;调pH至5;
经0.45tzm滤膜过滤;流速1mL/min;柱温30℃;
进样体积20L.在该研究中,As"的出峰时间约
为2.45min;As"出峰时问约为9.53rain;菌株的
OD∞值使用紫外可见分光光度计NanoDrop1000
(Thermo,USA)测定.
2结果与讨论
2.1分离菌株的形态学特征
通过筛选分离获得的菌株cll一35同时具有反硝
化和砷氧化功能.该菌株菌落较小且平滑,呈透明,
白色,表面湿润,边缘整齐,生长较快;通过革兰氏染
色,镜检观察,发现该菌株为革兰氏阴性菌.
2.216SrDNA序列测定及系统发育分析
通过BLAST检索与Genbank中的核酸序列进
行同源性比对(/)发
现,cl1.35菌株与木糖氧化无色杆菌(Achromobacter
xylosoxidans),反硝化无色杆菌(Achromobacter
denitrifics)和Achromobacterinsolitus的相似性都
达到99%以上,综合以上结果可以认为,菌株cl1.35
属于Achromobactersp.,使用ClustalX1.83和Mega
4.1软件进行系统发育分析,得出cll一35系统发育
树,见图1.图1显示,cll一35与Achromobacter
xylosoxidansC8B亲缘关系最近.
AchromobacterxylosoxidansJS1-2(DQ1049801) AchromobacterxylosoxMansJS1?1(DQ1049791 Achromobacterdenitrca?is22426(FJ8100801) AchromobacterxylosoxidansM66{HQ67660t1) AchromobacterxylosoxMansB8L(DQ4665681) AchromobacterinsolttusY2P1(EU2213791) AchromobacterxylosoxidansAU0665(hV4110191) Achromobacterxylosoxidansybb5(EU2146111) AchromobacterxylosoxidansIL-03(DQ9892132) AchromobacterxylosoxidansC8B(HQ4266481)
chromobacterspcll一35
图1基于16SrDNA序列同源性构建的c11-35系统发育树
Fig.1Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequencesofell一35andrelatedbacteria
该菌属分别用于反硝化¨和砷氧化Ⅲ的菌
株都有报道,但鲜见同时具有这2种功能的报道. 该多功能菌的存在使含砷生活污水(或工业废水) 的直接脱氮成为可能,具有很好的应用前景.另一
方面,有研究¨表明,耐砷反硝化菌在自然界可
能普遍存在,cll一35的分离也为此提供了依据. 2.3分离菌株的生长情况
图2显示了菌株cl1—35在3种培养基中的生
长情况.从图2可见,在AM培养基中,菌株c11—35 在停滞期(0～16h)没有生长,在32h达到对数期
顶峰,并立即进入衰亡期,而在NAM培养基中,停
滞期(0～16h)有缓慢生长现象,对数期延长至48 h,并且NAM中的长势较AM中更好.这说明在含砷情况下,NO一的存在可以促进菌株更好地生长,这可能是由于菌株对NO一的反硝化为其提供了能量.在NM与NAM培养基中,停滞期都有
生长,48h后开始进入衰亡期;在0～48h内,
NAM培养基中菌株的生长略高于NM培养基中, 最终,NM达到更高的峰值.
2.4菌株的反硝化能力
由图3可见,cll一35在NM培养基中,4d内将
C(NO一)由12.69mmol/L降解至5.88mmol/L,并
几乎达到平衡,去除率达53.65%;而在NAM培养
基中,4d内将C(NO一)由l2.23mmol/L降解至
环境科学研究第24卷
时间/l1
-
I-NM培养基-O-AM培养基-~NAM培养基
-
o-NM培养基空白-0-AM培养基空白△NAM培养基空白图2菌株c11-35在3种培养基中生长曲线
Fig.2Growthoftheell一35in3kindsofmedium
接种菌株e11-35的NM培养基中的c(NO3一)
◆接种菌株cll-35的NAM培养基中的c(NO一)
◆接种菌株cll-35的NM培养基中的c(NO2)
★接种菌株cll?35的NAM培养基中的c(NO2一)
.口_空白NM培养基中c(NO一)
o空白NAM培养基中c(NO3一)
_◇^空白NM培养基中c(NO一)
△空白NAM培养基中c(NO2一)
图3菌株cll-35的反硝化能力
Fig.3Denitrificationabilityofcll一35
3.03mmol/L,去除率达75.27%,同时NO:～有少
量的积累.根据物质守恒,推测其余被反硝化至气
态氮(NO.或N:).在菌株生长停滞期(0～16h),
c(NO一)基本不变,同时NO:一也没有相应的积
累;而在对数期(16—32h)反硝化速率加快,去除
率分别为47.10%和61.90%,占总反硝化量的
85.30%和82.67%.若从C(NO,一)和C(NO一)的
变化来看,NAM培养基中细菌相对于NM培养基
在对数生长期(16～32h)的反硝化能力增强了
1.31倍,说明As"的存在并未抑制菌株的活性,
反而促进了菌株的反硝化作用,推测这与好氧反
硝化的机理有关.
孙庆鑫等曾提出一种假设:即好氧反硝化
菌中存在一种可以醌氢类为供电子体,且不受氧
分子抑制的orNAR(oxygenresistednitratereduc.
tase,硝酸盐还原酶),和一种以Cytbcl为供电子
体,且不受氧分子抑制的orNIR(oxygenresisted nitritereductase,亚硝酸盐还原酶).根据该假设,
推测好氧反硝化菌中好氧反硝化代谢过程中有2
条电子通道,一条通道为正常的好氧呼吸通道,即
电子经NADPH和NADPH-Q传递给醌氢,再传递给细胞色素(Cytbcl,Cytc,Cytaa3),最后传递给氧
分子;这条通道中Cytc和Cytaa3之间的电子传递
存在"瓶颈"效应,电子流过剩时则经由第2条
通道传递.过剩的电子通过醌氢类传电子体传递
给orNAR,orNAR又将电子传递给NO一,将其还
原为NO一,NO:一在orNIR的作用下接受从Cytbcl 传来的电子被还原为低价态的氮.而在As¨存在
的情况下,As"的氧化给亚砷酸盐氧化酶A (AoxA)提供了2个电子,经由亚砷酸盐氧化酶B (AoxB)传递给Cytbcl,使得Cytc中出现了过剩的
电子流,加剧了Cytc和Cytaa3之间的电子传递的"瓶颈"效应,迫使Cytbcl中的电子流向orNIR,为NO一的还原提供电子.这也就解释了为什么As¨的存在对NO:一还原的影响最大,强化效果最好. SUN等研究发现,在厌氧的环境下砷氧化
和反硝化之问的联系试验中,当As¨存在时,反硝
化过程中出现了N0的积累.由于试验条件的限制,笔者并未对N0的含量进行测量.好氧条件下
砷是否对NO的还原有着相同的抑制作用有待进
一
步试验证明.
2.5菌株的砷氧化能力
由图4可看出,c1l一35在AM培养基中,32h
内C(As")由0.6256mmol/L降至0.0024mmol/L,
几乎达到平衡,As"氧化效率达99.62%,环境中
积累的C(As")为1.0027mmol/L;在NAM培养
基中,32h内c(As")由0.9793mmol/L降至
第10期曾琳等:一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定接种菌株cll一35的AM培养基中的c(As")
◆接种菌株cl1.35的NAM培养基中的c(As")
★接种菌株cl1—35的AM培养基中的c(As)
早接种菌株cl1.35的NAM培养基中的c(As)
o空白AM培养基的c(As")
空白NAM培养基的c(As")
△空白AM培养基的c(As)
-
V-空白NAM培养基的c(As)
图4菌株clI-35的砷氧化能力
Fig.4Arseniteoxidizingabilityofcll一35
0.0052mmol/L,As氧化效率达到99.47%,环境
中积累的c(As")为0.9196mmol/L.在菌株生长
停滞期(0～16h),NAM培养基中菌株长势更好,
AM培养基中菌株几乎没有生长(见图2),NAM
培养基中As"被氧化得更迅速,同时开始大量积
累As".而在AM培养基中,虽然也有部分As"被
氧化,但是As"的积累却不明显.因此,可能菌株
cll一35仅仅利用砷氧化作为一种解毒机制,而不是
以As"为电子供体为细胞生长提供能量.而在对
数生长期,在AM培养基中菌株生长更为迅速,同
时含砷Minimal培养基中As开始大量积累,其
中的C(As")超过了NAM培养基.同时绝大部分
As"在对数生长期结束时都已经被氧化,但培养
基质中却没有出现等量的As",这有可能是因为
As与磷酸基团有类似的结构,通过磷酸通道蛋
白(phosphatetransporter,Pit/Pst)进入细胞,并在细菌体内聚集.
CAI等研究发现,很多微生物都含有与砷
解毒有关的基因,经常在一起成簇出现,可称为"砷解毒基因岛"或"砷解毒基因簇".可以推测在
该株多功能砷氧化菌中,同时拥有亚砷酸盐氧化酶和砷酸盐还原酶的表达基因.氧化和还原2个过程在菌株中同时发生,很可能存在动态平衡,且氧化速率远大于还原速率.根据SANTINJ等的
研究,砷的氧化解毒机制中存在下列反应:
2H3AsO3+O2=HAsO4一+H2AsO4一十3H
而反硝化反应是产碱的,因此在NAM培养基
中砷氧化的动态平衡反应能向反应式右边移动. 此外,由于NO一可以作为供同化作用的电子受体,因此在NAM培养基中生长得更为繁盛,同时也导致了细菌活性更大,解毒能力更强,体内能够积累更多的As".这些因素都导致了砷氧化的动态平衡反应能向上述反应式右边移动,在宏观上表现为NO一增强了砷氧化的能力.
3结论
a.筛选出一株同时具有反硝化和砷氧化功能
的菌株cll一35,经鉴定为革兰氏阴性菌,属于Achromobactersp..
b.As"对菌株cll一35的生长有明显的抑制作用,而NO一的存在缓和了这种抑制.在O～16h, cl1.35在AM培养基中没有生长,在32h达到对数期顶峰,并立即进入衰亡期;而在NAM培养基中, 0～16h菌株有缓慢生长,且在48h后才进入衰
C.As"的存在促进了菌株cll一35的反硝化作
用.在NM培养基中NO一的去除率为53.65%,而
在NAM培养基中NO一的去除率为75.27%.
d.在含NO,一和不含NO一的条件下,cll一35
对As"的氧化效率都达到了99%以上,而在含
NO一的条件下,菌株的生长趋势更好,氧化速率
更快.在含NO一的条件下,16h内As"的氧化效
率就达到了84.96%,而不含NO一的条件下,As"
的氧化效率为36.64%.
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(责任编辑:郑朔方)。