产抗菌肽芽孢杆菌的发酵工艺研究

产抗菌肽芽孢杆菌的发酵工艺研究
曹丁;黄魁英;林创伟;夏枫耿;张高贤;张玲华
【摘要】[目的]通过对产抗菌肽芽孢杆菌GL08的发酵培养基进行优化,以提高抗菌肽的产量.[方法]以GL08为出发菌株,在初始发酵培养基的基础上,首先用单因子试验确定最适合的碳氮源,进而通过正交试验确定最优的碳氮源配比.最后在500 L 中试水平上对优化后的培养基进行了验证和生长特性研究.[结果]优化后的发酵培养基为葡萄糖30 g/L,蔗糖20 g/L,国产酵母膏30 g/L,黄豆饼粉10g/L.在此培养基中,500 L中试水平杀菌效价为15 311 IU/ml,提高约90％,同时又降低了生产成本,提高了抗菌肽的稳定性.[结论]优化后的发酵工艺为抗菌肽工业化生产提供了行之有效的解决方案.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2015(000)013
【总页数】3页(P58-60)
【关键词】抗菌肽;芽孢杆菌;发酵;工艺优化
【作者】曹丁;黄魁英;林创伟;夏枫耿;张高贤;张玲华
【作者单位】广州市微生物研究所,广东广州510663;广州市微生物研究所,广东广州510663;广州市微生物研究所,广东广州510663;广州市微生物研究所,广东广州510663;广州市微生物研究所,广东广州510663;华南农业大学生命科学学院,广东广州510642
【正文语种】中文
【中图分类】S188+.4;Q814
抗菌肽又称抗微生物肽，是指广泛存在于生物体内，能够抵抗外界病原菌侵害，具有多种免疫活性的先天性防御小分子多肽类物质［1］。

近年来由于滥用抗生素引发耐药性菌株增加，又因禽畜制品的抗生素残留问题严重危害人类健康，而抗菌肽由于特殊的抑菌机理不易耐药，抗菌谱广，使用安全性高，有望作为抗生素的替代品［2－3］。

研究者将抗菌肽基因克隆于酵母中进行表达，生产抗菌肽酵母制剂，用作畜禽及水产饲料添加剂，预防及治疗动物疫病［4］。

然而用酵母表达的抗菌肽不稳定且效价偏低，自身耐受性差，易被蛋白酶降解，生产工艺复杂，成本偏高，不易进行大规模生产，限制了其生产应用［5］。

1985年，Bulla等［6］报道芽孢杆菌能产生多肽类的抗生素，这些抗菌肽包括Lleines、Bacitracins及Gramieidins等，它们都具有线状或环状结构，分子量小，热稳定性好，含有D－氨基酸，能耐受蛋白酶的水解作用。

目前，有关芽孢杆菌
分泌的抗菌肽研究主要用于植物病害的防治，而用于防治人类、动物疾病的研究较少［7］。

然而此类抗菌肽由于来源可靠，表达稳定，无污染，低成本，具有广阔的应用前景。

但多数芽孢杆菌产生的抗菌肽组分较少，抗菌谱相对较窄，且产量较低，无法规模生产［8］。

面对巨大的市场需求，开发高产量活性的抗菌肽芽孢杆菌制剂迫在眉睫。

该研究的抗菌肽是来源于一株枯草芽孢杆菌工程菌GL08，菌株绿色安全，无需诱导，可稳定表达多种抗菌肽组分，通过优化发酵工艺后以提高效价，降低成本，从而实现工业化生产。

抗菌肽－芽孢杆菌制剂的研制成功将成为代替抗生素的新型饲料添加剂或生物肥料，具有较高的经济及社会价值。

1 材料与方法
1.1 供试菌产抗菌肽的枯草芽孢杆菌GL08和大肠杆菌K12D31由广州市微生物
研究所提供。

1.2 主要试剂及培养基种子培养基:葡萄糖20 g/L，酵母抽提物20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 7.0，固体培养基加20 g/L的琼脂粉。

初始发酵培养基:葡萄糖20
g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，氯化钠 10 g/L，磷酸二氢钾 0.8
g/L，七水合硫酸镁 0.2 g/L，碳酸钙 4 g/L，pH 6.7。

效价检测用培养基:NaCl
10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖 5 g/L，琼脂粉 20 g/L，pH 7.0。

酵母抽提物、胰蛋白胨:英国 Oxoid公司;琼脂粉:广州环凯生物科技有限公司;其他
试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备生化培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;DHZ－DA大容量全温
振荡器:太仓市实验设备厂;752N型紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;50 L、500 L不锈钢发酵罐:上海洋格生物设备有限公司。

1.4 GL08菌株摇瓶发酵将斜面保存的GL08菌株接种于种子培养基中，30℃、150 r/min培养24 h，然后以1%的接种量接种于初始发酵培养基中，30℃、150 r/min培养，培养过程分别取样监测各种生理指标。

1.5 GL08菌株的500 L发酵罐中试试验将GL08菌种接种于种子培养基中，置于30℃、150 r/min培养20～24 h，待菌体长至稳定期后再接种于50 L种子罐，
同样30℃培养8～9 h后，待菌体长至对数生长期中期时，过种到500 L发酵罐，每隔2 h取样检测发酵液的各项参数。

1.6 GL08菌株发酵过程各项生理指标测定
1.6.1 菌体生物量测定。

根据发酵液活菌数的对数值和吸光度成一定的线性关系原理，通过测定其在570 nm下的吸光度来间接反映菌体的生长情况。

1.6.2 pH测定。

用PHS-25数显酸度计测定。

1.6.3 还原糖测定。

用3，5-二硝基水杨酸法测定。

1.6.4 杀菌效价测定。

参照文献［9］的方法，采用标准琼脂孔穴扩散法，以大肠
杆菌K12D31为指示菌，制备效价平板。

然后用打孔器(直径2.7 mm)打孔，每孔分别加入5 μl GL08菌株发酵上清，共3个平行板，每个平板重复3次，同时加
入标准样(标定为1万效价)对照，37℃培养14～16 h后，测定抑菌圈直径。

用此公式计算杀菌效价:杀菌效价(IU/ml)=2X×1 000 ×稀释倍数，X=(抑菌直径－
2.7)/2.1，样品杀菌效价校正值=样品杀菌效价实测值*10 000/标准品杀菌效价实
测值。

为减小不同测量批次之间的误差，该研究中样品的效价均为校正值。

2 结果与分析
2.1 GL08菌株摇瓶最佳发酵时间的确定将GL08菌株接种于初始发酵培养基中，分别于不同时间取样检测发酵上清的抑菌效价，结果见表1。

表1 GL08菌株在初始培养基中不同培养时间的效价发酵时间h杀菌效价IU/ml
发酵时间h杀菌效价IU/ml 6 0 30 6 387±41 12 2 494±50 48 5 802±87 18 3 981±128 72 3 922±62 24 6 765±134
由表1可知，GL08菌株在初始发酵培养基中培养24 h效价达到最高，之后逐渐
下降，因此选择24 h为摇瓶发酵培养的终点。

2.2 GL08菌株发酵培养基的优化
2.2.1 最佳碳源。

分别用20 g/L的可溶性淀粉、麦芽糊精、甘油、蔗糖、果糖和
乳糖作为单一碳源替代初始发酵培养基中的葡萄糖，其余配方同初始发酵培养基，按“1.4”的方法接种培养，并取样检测效价等各指标，结果见图1。

图1 GL08在不同碳源下的抑菌效价
从图1可以看出，GL08菌株在蔗糖作为单一碳源的培养基中，抑菌效价最高(8 421 IU/ml)，考虑到葡萄糖作为速效碳源能迅速启动菌体生长，为缩短发酵周期，故选择葡萄糖与蔗糖搭配使用作为复合碳源。

2.2.2 最佳氮源。

在筛选出合适碳源的基础上，分别用30 g/L的国产蛋白胨、国
产酵母浸膏、牛肉膏、黄豆饼粉、硫酸铵和干酪素分别替代初始发酵培养基中的进口蛋白胨和酵母抽提物作为单一氮源，其他成分相同，在摇瓶水平进行发酵培养试验，并取样检测效价等各指标，结果见图2。

图2 GL08在不同氮源中的抑菌效价
从图2可以看出，GL08在不同氮源中的抑菌效价差异很大，在无机氮源硫酸铵中长势较差，效价也低，说明硫酸铵单独使用并不能满足菌体生长和合成产物的需求。

在国产酵母膏中的效价最高(9 468 IU/ml)，黄豆饼粉和初始培养基次之(分别为8 622和8 468 IU/ml)，但在黄豆饼粉中菌体长势最好，考虑到国产酵母膏和黄豆
饼粉价廉易得，因此选择国产酵母膏和黄豆饼粉作为氮源搭配使用。

2.2.3 正交试验优化碳源和氮源的最佳配比。

在单因素试验确定了GL08菌株合适
的碳源和氮源后，由于不同碳氮源之间具有交互作用，因此用4因素3水平正交表，以杀菌效价为指标用来确定不同碳氮源之间的最佳配比，正交试验设计见表2，每组发酵培养24 h后取样检测抑菌活性。

表2 正交试验的因素水平 g/L水平因素葡萄糖蔗糖国产酵母膏黄豆饼粉1 10
10 20 5 2 20 20 30 10 3 30 30 40 15
由表3可知，在GL08菌株发酵培养基的碳氮源中，对发酵上清杀菌效价的影响
排序为国产酵母膏、葡萄糖、黄豆饼粉、蔗糖，即国产酵母膏的含量对抗菌肽产量影响最大，葡萄糖次之，从而得出优化的最佳配方是葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，国产酵母膏30 g/L，黄豆饼粉10 g/L，理论预测效价为14 518 IU/ml。

在摇瓶
中对优化后的发酵培养基配方进行验证，测得杀菌效价为14 023 IU/ml，与理论
预测值接近，比正交试验效价最高的第8组略高。

2.2.4 最佳发酵配方的中试验证及GL08菌株的生长特性。

按照优化后GL08菌株
的发酵培养基配方，将GL08摇瓶种子于30℃、150 r/min摇床培养24 h后，按3%的接种量接种于50 L种子罐中，经过二级种子扩大培养，在500 L的发酵罐
中以同样的工艺条件进行发酵培养，并用初始发酵培养基作为对照，验证优化培养基的发酵水平。

GL08菌株在500 L发酵罐中，从接种开始，每隔1～2 h取样测
定发酵液的pH、OD570、抑菌效价和还原糖含量，结果见图3、4。

表3 GL08发酵培养基的正交试验结果组别葡萄糖蔗糖国产酵母膏黄豆饼粉抑
菌效价IU/ml 1 1 1 1 1 8 611 2 1 2 2 2 12 049 3 1 3 3 3 9 455 4 2 1 2 3 12 318 5 2 2 3 1 9 393 6 2 3 1 2 11 935 7 3 1 3 2 10 500 8 3 2 1 3 13 087 9 3 3 2 1 13 078 K110 039 10 476 11 211 10 361 K2 11 215 11 510 12 482 11 495 K3 12 221 11 489 9 783 11 620 R 2 182 1 013 2 699 1 259
图3 GL08在500 L发酵罐的初始培养基中生长特性
图4 GL08在500 L发酵罐的优化培养基中生长特性
从图3可以看出，GL08菌株在500 L发酵罐的初始培养基中，经过短暂的延滞期，从第2 h起开始生长，可能是因为接种量大，且发酵培养基与种子培养基营养成分接近。

2～8 h为对数生长期，到8 h后经过短暂的稳定期后，迅速进入衰亡期，OD570值下降趋势明显。

杀菌效价的变化趋势与菌体生物量的变化趋势大体一致，随着菌体的生长，抗菌肽逐步产生，在发酵过程中，抗菌肽的产生量与生物量呈正相关，到8 h菌体的生物量达到最大(OD570=12.16)，抗菌肽的效价也达到最大
为8 035 IU/ml，从第9 h起，菌体开始衰亡自溶，OD570值迅速下降，抗菌肽
的效价也随之下降。

pH在整个发酵过程中，刚开始随菌体生长而有所下降，从9 h起一直到发酵结束，pH开始逐步上升。

说明发酵液pH上升，效价和OD570
下降的时间点是一致的，此时间点即为放罐的最佳时间。

从图4可以看出，GL08菌株在500 L发酵罐的优化发酵培养基中，从第4 h开始进入对数生长期，8 h OD570达到最高，之后开始缓慢下降，菌体进入衰亡期。

在发酵初期，发酵液的杀菌效价随着菌体的生长缓慢增长，8～14 h效价高速增长，到14 h达到最高，之后保持相对稳定的状态。

GL08菌株在整个发酵过程中pH
维持在5～6，变化趋势不明显。

由此可知，GL08菌株是在稳定期大量产生抗菌肽，OD570达到最高点约6 h后，效价达到最高为15 311 IU/ml，之后相对稳定，此时可以结束培养。

由此可知，GL08菌株在优化培养基中，效价大幅提高。

在相同培养基中500 L发酵罐的菌体生物量和效价都比摇瓶有所提高，这可能是因为发酵罐的通风和搅拌更利于物质传递，产生更高的溶氧，更有利于菌体生长和代谢产物的合成。

在500 L 发酵罐中，抗菌肽在初始培养基中效价为8 035 IU/ml，在优化培养基中的效价为15 311 IU/ml，与初始培养基相比，优化后的培养基效价提高约90%，且抗菌肽在发酵后期的稳定性也得到提高。

3 结论与讨论
该研究以枯草芽孢杆菌GL08为研究对象，通过正交试验设计优化了高效表达抗菌肽的发酵培养基组成为:葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，国产酵母膏30 g/L，黄豆饼粉10 g/L，氯化钠10 g/L，磷酸二氢钾0.8 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，碳酸钙4 g/L，优化后摇瓶的杀菌效价为14 023 IU/ml，比优化前提高了一倍。

并在500 L中试规模水平上对优化后的发酵培养基进行了验证，通过观察比较GL08菌株在初始培养基和优化后培养基中的生长特性，发现抗菌肽在优化培养基中的效价为15 311 IU/ml，与初始培养基效价8 035 IU/ml相比提高约90%。

此外，优化后的培养基用廉价易得的国产组分代替昂贵的进口成分，使生产成本大大降低，且抗菌肽在发酵后期的稳定性也得到提高。

综上所述，该生产工艺调控简单，成本低，发酵周期短，且表达稳定，具有较高的实际应用价值。

该研究在500 L中试水平进行了多次发酵试验，研究了GL08菌株分泌表达抗菌肽的各项指标，初步掌握了其生长特性，为后期进一步研究抗菌肽的中试调控工艺提供了参考，并为抗菌肽的大规模生产奠定了基础。

参考文献
［1］NAKATSUJI T，GALLO R L.Antimicrobial peptides:old molecules with new ideas［J］.J Invest Dermatol，2012，132(3 Pt 2):887 －895.
［2］汪以真，韩新燕，许梓荣.哺乳动物抗菌肽及其在畜牧生产上的应用前景［J］.中国畜牧杂志，2002，38(4):52 －54.
［3］王志强，张爱忠，姜宁，等.抗菌肽在畜牧业上的应用研究及问题分析［J］.
黑龙江八一农垦大学学报，2013(5):21 －26.
［4］梁洁，李运南，董加喜.抗茵肽饲喂肉鸡的应用研究［J］.现代食品科技，2009(4):416 －419.
［5］李敏惠，杨平，何正波.昆虫抗菌肽及其基因工程研究进展［J］.应用与环境
生物学报，2006，12(3):437 －440.
［6］BULLA L A JR，HOCH J A.Biology of the Bacilli［M］//DEMAIN A L，SOLOMON N A.Biology of in dustrial microorganisms.Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif，1985:57 －58.
［7］赵朋超，王建华，权春善，等.枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展［J］.中国生物工程杂志，2010，30(10):108 －113.
［8］马文山，廖富苹，范雪云.细菌抗菌肽的研究进展及其应用［J］.生物技术通报，2008(3):39－46.
［9］梁洁，彭中键，梁淑娃，等.转基因酵母菌深层发酵生产抗菌肽的研究［J］.
现代食品科技，2009，25(6):639 －640.。