芦笋茎尖遗传转化体系的建立与优化
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犃西犮狋北犪犃农犵狉业犻犮学狌犾狋报狌狉 犪犲２０犅２狅０狉犲，２犪犾９犻（１狅犮）犮犻：１犱０犲９狀狋１犪１犾犻６狊犛犻狀犻犮犪 网网络络出出版 版日地期址：：２ｈｔ０ｔ２ｐ０：／０／１ｋ０ｎ７ｓ ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．ｓ．２０２００１０７．０９２０．００ｄ６ｏｉ．ｈ：１ｔ０ｍ．ｌ７６０６／ｊｉ．ｓｓｎ．１００４１３８９．２０２０．０１．０１３
芦笋茎尖遗传转化体系的建立与优化
张 园１，２，刘正杰１，林 春１，２，闫亚泽１， 袁加红１，王 入１，毛自朝１，２，杨焕文３
（１．云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 ６５０２０１；２．云南农业大学特色小宗作物研究中心， 昆明 ６５０２０１；３．云南农业大学烟草学院，昆明 ６５０２０１）
摘 要 通过优化根癌农杆菌ＥＨＡ１０５（含有ｐＢＩ１２１表达载体）介导的茎尖遗传转化条件，包括抑菌抗生素 类型及浓度、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间、卡那霉素浓度等影响因素，建立芦笋品种‘达宝利’遗传转化 体系。以０．１～０．３ｃｍ长的芦笋茎尖为转化受体，用ＭＳ液体培养基（ＭＳ＋蔗糖３％＋乙酰丁香酮１５０ μｍｏｌ·Ｌ－１）悬浮菌体至ＯＤ６００为０．６，侵染茎尖１５ｍｉｎ，２０℃避光共培养４ｄ；抗性茎尖在筛选培养基 （１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋嘧啶醇０．５ｍｇ·Ｌ－１＋羧苄青霉素２００ｍｇ·Ｌ－１＋ 卡那霉素５０ｍｇ·Ｌ－１）上诱导长芽与生根，可获得抗性植株，经ＰＣＲ、ＧＵＳ组织化学染色和ｑＲＴＰＣＲ检测， 获得阳性植株。 关键词 芦笋；茎尖；遗传转化；参数优化；ＧＵＳ；ｑＲＴＰＣＲ 中图分类号 Ｓ５１３ 文献标志码 Ａ 文章编号 １００４１３８９（２０２０）０１０１０９０８
建立芦笋茎尖遗传转化体系，为后续遗传转化研 ２０℃暗处共培养，选取部分经共培养的茎尖，进
究奠定基础。
行犌犝犛瞬时表达率统计，以确定最佳转化条件。
１ 材料与方法Βιβλιοθήκη 农杆菌浓度：用活化好的不同ＯＤ６００值根癌 农杆菌菌液（ＯＤ６００分别为０．２、０．４、０．６、０．８和
１．１ 供试材料与试剂
１．０）侵染芦笋茎尖，再接种至共培养基，置于
供试受体材料为芦笋品种‘达宝利’在ＭＳ培 ２０℃暗处培养３ｄ。取共培养结束后的茎尖进行
养基上扩繁得到的新的幼嫩茎尖。挑选状态良好 组织化学染色，统计犌犝犛瞬时表达率。
的芦笋茎尖至预培养基（１／２ＭＳ培养基），置于 农杆菌侵染时间：将根癌农杆菌调节至
２６℃光照培养２ｄ，作为后续转化受体材料。农 ＯＤ６００值为０．６，侵染外植体的时间分别设定为
杆菌ＥＨＡ１０５菌株以及质粒载体ｐＢＩ１２１由云南 ５、１０、１５、２０、３０和４０ｍｉｎ，侵染完成后，将受体材
芦笋（犃狊狆犪狉犪犵狌狊狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊Ｌ．）是多年生宿 对于芦笋转基因育种等相关研究较少，且不够深 根性草本植物，百合科天门冬属，学名石刁柏，属 入。Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ等［１０］将不带外源质粒的根癌 国宴常用蔬菜，常有“蔬菜之王”美誉［１］。芦笋除 农杆菌侵染芦笋茎，并在转化材料检测到了胭脂 具备很高食用价值之外，还能对人体多种疾病有 碱和农杆菌素碱的存在，证实了应用农杆菌侵染 预防和治疗效果，如降血糖、降血脂、抗癌等［２］。 法在转化芦笋中的可能性，但该研究并没有进行 目前，国际芦笋市场需求量正在日益增长，其中中 含有外源质粒农杆菌的遗传转化，也未对转基因 国芦笋约占国际芦笋消耗量４０％，芦笋产业已成 材料农杆菌基因表达情况以及遗传转化影响因素 为芦笋栽培产地农民增收致富重要来源［３４］。目 做深入研究；ＬｉｍａｎｔｏｎＧｒｅｖｅｔ等［１１］用农杆菌 前，市场上所用芦笋栽培品种虽然产量和品质较 ＡＧＬ１将ｕｉｄＡ和ｎｐｔⅡ基因转入芦笋胚性系。 好，但多易感病害，特别是茎枯病、褐斑病和炭疽 虽然上述研究实现了芦笋转基因，但其遗传转化 病等，因此筛选高产、高质和抗病品种是芦笋育种 体系效率较低且研究不够系统。鹿志伟等［６］在前 工作的重点［５］。芦笋品种以杂交育种和系统选育 人研究基础上，开展了农杆菌介导的芦笋遗传转 等常规选育方法为主，但常规选育过程长，育种流 化影响因素研究，但该研究受体材料仍是以组织 程繁琐，可控性较差且育种效率较低；与之相比， 培养过程中形成的数量较少的芦笋胚状体为外植 转基因育种能克服常规育种手段许多弊端，如可 体，导致获得遗传转化植株的群体不够大。为解 以定向遗传改良、育种周期短且可控性较高等，因 决上述芦笋转基因研究中存在的问题，本研究以 此，越来越受到育种者的重视与广泛利用［６］。 芦笋组织培养过程中得到的茎尖为外植体，基于
目前，国内外对于芦笋的研究主要集中在常 瞬时表达体系分析影响农杆菌转化的诸多参数， 规育种［５］、种植栽培与管理［７］、采后生理及贮藏技 包括农杆菌侵染浓度、侵染时间、乙酰丁香酮 术［８］、化学成分与药理［９］、组织培养［１］等方面，而 （ＡＳ）浓度、共培养时间、分化筛选培养基中卡那
收基第通稿 金 一 信日 项 作 作期目者者：：：：２云 张 毛 杨０１南 自 焕 ９省 园 朝 文０６，，，农１女 男 男０业，，， 基硕博博 础士 士 士修研，，研教 教回究究授 授日联生， ，期合，主 主从：２专要 要０事１项从 从９蔬（事 事１２菜００植 植１功２７物 物８Ｆ能生 分Ｇ基０理 子０因１学 生０组０研 物２学究 学）研；研。云究Ｅ究南。ｍ。Ｅ省ａＥｉｌｍ农：ｍａｍｉ业ａｌａｉｌ：ｏ基１：２３ｙ０础６ｈ１１ｗ０研５ｚｙ１ｉｎｃ究７ａｈ０ｕａ联１ｏ＠＠合＠１１２１专６６２３６项．．ｃｃ．ｏｃ（ｏ２ｏｍｍ０ｍ１８ＦＧ００１０１９）。
·１１０·
西 北 农 业 学 报
２９卷
霉素浓度及抑菌抗生素种类等。在优化的遗传转 中，然后加入侵染液（含ＡＳ）浸泡芦笋茎尖，在恒
化参数基础上，获得转基因植株，并进行ＰＣＲ、 温摇床慢速摇５～４０ｍｉｎ，再去除菌液，在无菌滤
ＧＵＳ组织化学染色检测和ｑＲＴＰＣＲ分析，初步 纸上吸干茎尖表面残留菌液，接种于共培养基，于
芦笋茎尖遗传转化体系的建立与优化
张 园１，２，刘正杰１，林 春１，２，闫亚泽１， 袁加红１，王 入１，毛自朝１，２，杨焕文３
（１．云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 ６５０２０１；２．云南农业大学特色小宗作物研究中心， 昆明 ６５０２０１；３．云南农业大学烟草学院，昆明 ６５０２０１）
摘 要 通过优化根癌农杆菌ＥＨＡ１０５（含有ｐＢＩ１２１表达载体）介导的茎尖遗传转化条件，包括抑菌抗生素 类型及浓度、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间、卡那霉素浓度等影响因素，建立芦笋品种‘达宝利’遗传转化 体系。以０．１～０．３ｃｍ长的芦笋茎尖为转化受体，用ＭＳ液体培养基（ＭＳ＋蔗糖３％＋乙酰丁香酮１５０ μｍｏｌ·Ｌ－１）悬浮菌体至ＯＤ６００为０．６，侵染茎尖１５ｍｉｎ，２０℃避光共培养４ｄ；抗性茎尖在筛选培养基 （１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ０．１ｍｇ·Ｌ－１＋嘧啶醇０．５ｍｇ·Ｌ－１＋羧苄青霉素２００ｍｇ·Ｌ－１＋ 卡那霉素５０ｍｇ·Ｌ－１）上诱导长芽与生根，可获得抗性植株，经ＰＣＲ、ＧＵＳ组织化学染色和ｑＲＴＰＣＲ检测， 获得阳性植株。 关键词 芦笋；茎尖；遗传转化；参数优化；ＧＵＳ；ｑＲＴＰＣＲ 中图分类号 Ｓ５１３ 文献标志码 Ａ 文章编号 １００４１３８９（２０２０）０１０１０９０８
建立芦笋茎尖遗传转化体系，为后续遗传转化研 ２０℃暗处共培养，选取部分经共培养的茎尖，进
究奠定基础。
行犌犝犛瞬时表达率统计，以确定最佳转化条件。
１ 材料与方法Βιβλιοθήκη 农杆菌浓度：用活化好的不同ＯＤ６００值根癌 农杆菌菌液（ＯＤ６００分别为０．２、０．４、０．６、０．８和
１．１ 供试材料与试剂
１．０）侵染芦笋茎尖，再接种至共培养基，置于
供试受体材料为芦笋品种‘达宝利’在ＭＳ培 ２０℃暗处培养３ｄ。取共培养结束后的茎尖进行
养基上扩繁得到的新的幼嫩茎尖。挑选状态良好 组织化学染色，统计犌犝犛瞬时表达率。
的芦笋茎尖至预培养基（１／２ＭＳ培养基），置于 农杆菌侵染时间：将根癌农杆菌调节至
２６℃光照培养２ｄ，作为后续转化受体材料。农 ＯＤ６００值为０．６，侵染外植体的时间分别设定为
杆菌ＥＨＡ１０５菌株以及质粒载体ｐＢＩ１２１由云南 ５、１０、１５、２０、３０和４０ｍｉｎ，侵染完成后，将受体材
芦笋（犃狊狆犪狉犪犵狌狊狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊Ｌ．）是多年生宿 对于芦笋转基因育种等相关研究较少，且不够深 根性草本植物，百合科天门冬属，学名石刁柏，属 入。Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ等［１０］将不带外源质粒的根癌 国宴常用蔬菜，常有“蔬菜之王”美誉［１］。芦笋除 农杆菌侵染芦笋茎，并在转化材料检测到了胭脂 具备很高食用价值之外，还能对人体多种疾病有 碱和农杆菌素碱的存在，证实了应用农杆菌侵染 预防和治疗效果，如降血糖、降血脂、抗癌等［２］。 法在转化芦笋中的可能性，但该研究并没有进行 目前，国际芦笋市场需求量正在日益增长，其中中 含有外源质粒农杆菌的遗传转化，也未对转基因 国芦笋约占国际芦笋消耗量４０％，芦笋产业已成 材料农杆菌基因表达情况以及遗传转化影响因素 为芦笋栽培产地农民增收致富重要来源［３４］。目 做深入研究；ＬｉｍａｎｔｏｎＧｒｅｖｅｔ等［１１］用农杆菌 前，市场上所用芦笋栽培品种虽然产量和品质较 ＡＧＬ１将ｕｉｄＡ和ｎｐｔⅡ基因转入芦笋胚性系。 好，但多易感病害，特别是茎枯病、褐斑病和炭疽 虽然上述研究实现了芦笋转基因，但其遗传转化 病等，因此筛选高产、高质和抗病品种是芦笋育种 体系效率较低且研究不够系统。鹿志伟等［６］在前 工作的重点［５］。芦笋品种以杂交育种和系统选育 人研究基础上，开展了农杆菌介导的芦笋遗传转 等常规选育方法为主，但常规选育过程长，育种流 化影响因素研究，但该研究受体材料仍是以组织 程繁琐，可控性较差且育种效率较低；与之相比， 培养过程中形成的数量较少的芦笋胚状体为外植 转基因育种能克服常规育种手段许多弊端，如可 体，导致获得遗传转化植株的群体不够大。为解 以定向遗传改良、育种周期短且可控性较高等，因 决上述芦笋转基因研究中存在的问题，本研究以 此，越来越受到育种者的重视与广泛利用［６］。 芦笋组织培养过程中得到的茎尖为外植体，基于
目前，国内外对于芦笋的研究主要集中在常 瞬时表达体系分析影响农杆菌转化的诸多参数， 规育种［５］、种植栽培与管理［７］、采后生理及贮藏技 包括农杆菌侵染浓度、侵染时间、乙酰丁香酮 术［８］、化学成分与药理［９］、组织培养［１］等方面，而 （ＡＳ）浓度、共培养时间、分化筛选培养基中卡那
收基第通稿 金 一 信日 项 作 作期目者者：：：：２云 张 毛 杨０１南 自 焕 ９省 园 朝 文０６，，，农１女 男 男０业，，， 基硕博博 础士 士 士修研，，研教 教回究究授 授日联生， ，期合，主 主从：２专要 要０事１项从 从９蔬（事 事１２菜００植 植１功２７物 物８Ｆ能生 分Ｇ基０理 子０因１学 生０组０研 物２学究 学）研；研。云究Ｅ究南。ｍ。Ｅ省ａＥｉｌｍ农：ｍａｍｉ业ａｌａｉｌ：ｏ基１：２３ｙ０础６ｈ１１ｗ０研５ｚｙ１ｉｎｃ究７ａｈ０ｕａ联１ｏ＠＠合＠１１２１专６６２３６项．．ｃｃ．ｏｃ（ｏ２ｏｍｍ０ｍ１８ＦＧ００１０１９）。
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２９卷
霉素浓度及抑菌抗生素种类等。在优化的遗传转 中，然后加入侵染液（含ＡＳ）浸泡芦笋茎尖，在恒
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ＧＵＳ组织化学染色检测和ｑＲＴＰＣＲ分析，初步 纸上吸干茎尖表面残留菌液，接种于共培养基，于