木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析
作者：戴晶颜彦杨海胡伟
来源：《南方农业学报》2022年第01期
摘要：【目的】克隆木薯锌指转录因子基因MeDi19-1，分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列，利用生物信息学软件对其进行预测分析，并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体，通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞，观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。

利用酵母系统确定其转录激活活性，并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。

【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618 bp，共编码205个氨基酸残基，蛋白分子量为22416.79 Da，理论等电点（pI）为6.10，属于不稳定疏水蛋白，含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。

MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。

MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高，为83.50%。

MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。

MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中，具有转录激活活性，且活性区域在C端。

MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。

【结论】MeDi19-1基因属于Di19
基因家族成员，具有组织表达特异性，主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用，其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。

关键词：木薯;锌指转录因子;基因克隆;转录激活;表达分析
中图分类号： S533.035.3 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）01-0115-10
Cloning and expression analysis of zinc-finger transcription factor MeDi19-1 gene in cassava
DAI Jing1，2， YAN Yan1， YANG Hai2*， HU Wei1*
（1Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou 571101， China; 2College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，
Wuhan 430074， China）
Abstract：【Objective】 In this study，a zinc finger transcription factor MeDi19-1 was cloned from cassava. Its coding protein characteristics，subcellular localization，transcriptional activation activity and expression levels in different tissues of cassava were analyzed. This research laid a foundation for further exploration of the function and mechanism of MeDi19-1 in cassava. 【Method】The coding region sequence （CDS） of MeDi19-1 gene was amplified from cDNA of cassava KU50.The bioinformatics analysis predicted the physicochemical properties.The pNC-Green-SubC-MeDi19-1 fusion expression vector was also constructed. By Agrobacterium-mediated transfection of tobacco epidermal cells， and the fluorescence signal was observed to determine the protein subcellular localization.The yeast system was used to determine its transcriptional activation activity， and its tissue expression properties were analyzed based on transcriptomic data from different tissues in cassava. 【Result】The CDS of MeDi19-1 gene（OL620080） was 618 bp in length and encoded 205 amino acids with molecular weight of 22416.79 Da and theoretical isoelectric point （pI） of 6.10. MeDi19-1 protein belonged to an unstable hydrophobin and contained the zinc finger domainzf-Di19 which was typical in Di19 protein family. The se-condary structure of the MeDi19-1 protein contained irregularly coils（53.66%），α-helix（40.49%）， extended chain （4.39%）and β-turn（1.46%）. The amino acid sequence of MeDi19-1 protein had the highest similarity（83.50%） to the amino acid sequence of Hevea brasiliensis Di19-6 protein
（XP_021655585.1）. The promoter of MeDi19-1 contained the cis-acting element involved in the response to abscisic acid （ABA），gibberellin，jasmonic acid，stress response element and light response element. MeDi19-1 protein was located in nucleus and cytomembrane. MeDi19-1 protein had transcriptional activation activity，and its active region was at the C-terminus. MeDi19-1 showed high expression levels in leaf，mid-veins and storage root. 【Conclusion】The MeDi19-1 gene is a
member of the Di19 gene family， has tissue expression specificity and may play a regulatory role in leaves， mid-veins and storage roots， and its encoded protein is involved in the regulation of multiple physiological activities as transcription factors in cassava tissues.
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在蓮座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。

大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。

玉米
ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。

【本研究切入
点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。

【拟解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，
2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）和大肠杆菌D H5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。

亚细胞定位载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。

主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集
选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，
2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。

大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。

玉米
ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。

【本研究切入点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。

【拟解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，
2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。

亚细胞定位
载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。

主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集
选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，
2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。

大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。

玉米
ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。

【本研究切入点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。

【拟解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，
2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反轉录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。

亚细胞定位载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。

主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集
选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而過表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。

大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。

玉米
ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。

【本研究切入点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。

【拟解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，
2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。

亚细胞定位载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。

主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集
选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核細胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一
类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。

大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。

玉米
ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。

【本研究切入点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。

【拟解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，
2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。

亚细胞定位载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。

主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集
选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成
Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis
Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）
0 引言
【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。

Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。

因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。

【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。

Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。

目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。

研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。

拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。

此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。

棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。

水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang。