人血清白蛋白抗体的制备及多种免疫学方法的初步建立

第一章绪论
1.1引言
心脑血管疾病和糖尿病与肿瘤并称为人类健康三大杀手。

世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有1860万人死于心脑血管疾病。

2005年，据国家卫生部统计，我国每年有400万人死于此病，占死亡人数的60%以上。

目前我国有6000万人患有冠心病，7000万人患有脑梗塞或者心脑溢血，40岁以上的人中57%的人都患有不同程度的心脑血管病；近期，国际糖尿病联盟（IDF）主席阿尔特教授对糖尿病发病现状与发展趋势进行了统计，其结果令人震惊：目前全球已诊断的Ⅱ型糖尿病患者达1.3亿人，我国的确诊人数为4000万，位居世界第二，并以每年100万的速度递增。

WHO指出：如果不采取重大措施，2025年世界将出现3.8亿名糖尿病患者。

因此，对心血管疾病和糖尿病的早期诊断有重要的临床意义。

人血清白蛋白（HSA）是人体血清中含量最丰富的一种蛋白质，分子量为69KDa，是一种带有负电荷的大分子蛋白。

白蛋白的直径为7.2nm，肾小球毛细血管基底膜孔直径为5.5nm，少量通过基底膜的白蛋白99%可由近曲肾小管重新吸收[1]。

因此，正常情况下只有极少量的白蛋白可以通过尿液排出到体外。

如糖尿病、心血管疾病、肾小球肾炎以及涉及肾脏病变的自身免疫性疾病[2]，能影响肾小球毛细血管基底膜通透性和肾小管重吸收功能的疾病都可导致原尿中白蛋白病理性升高。

尿蛋白的多少在很大程度上同病情的变化成正相关。

一般情况下，尿蛋白轻度增加表示肾小管损害，而明显升高则常见于严重的肾小球病变。

因此，尿中微量白蛋白的检测对于与肾脏受损有关的疾病的早期诊断有重要的意义。

1.2 尿微量白蛋白的研究进展
1.2.1尿微量白蛋白的定义
尿微量白蛋白（MA）于1974年首次被提出并应用于临床，至80年代Mogensen将它作为糖尿病肾病的亚临床过渡阶段，尿微量白蛋白从而成为糖尿病肾病早期诊断的重要指标[3]。

尿微量白蛋白是指尿中白蛋白含量超出健康人参考范围，但不能用常规的生化方法检测这种微量的变化，是尿白蛋白的亚临床表现。

一般定义为尿白蛋白排泄率（AER）20～200μg/min[4]，或30～300mg/d[5]，或夜间尿标本排泄率15～150μg/min，这一临界值是根据发生糖尿病肾病的危险因素来界定的，它不能界定心血管疾病的危险增加。

近期的一项报告称，在一般人群中，整夜尿白蛋白排泄量大于5mg/min就已经是冠心病
和死亡的强预测指标了，同时糖尿病病人尿白蛋白在低于MA临界值时，就已经表现有心血管疾病危险的增加[6]。

因此，许多研究者建议重新修改普通人群中MA的定义，然而由于各个实验室尿标本收集及检测方法存在的差异，限制了这些实验数据的可比性。

对于尿微量白蛋白的定义还有待进一步的研究和统一。

1.2.2尿微量白蛋白检测的临床意义
发现微量白蛋白尿，进行早期综合治疗，会给肾脏带来康复的机会。

因此，在糖尿病肾病的诊断中，微量白蛋白尿的检测显得尤其重要。

不仅如此，近年来的研究还发现，尿微量白蛋白阳性是血管损伤的早期标志，也是糖尿病合并心血管疾病的危险因素，与Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病及高血压的预后均有密切关系。

1.2.2.1 尿MA在糖尿病肾病(DN)诊断中的临床意义
糖尿病（DM）已经逐渐成为人类健康第三大杀手，它对肾脏的影响是一个隐匿的发展过程。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的重要并发症之一。

糖尿病肾病早期，患者无任何不适症状，检查可发现微量白蛋白尿；临床蛋白尿期，以蛋白尿为特征，伴有水肿和血压升高；最后进入临床终末肾病期，出现肾功能衰竭、尿毒症[7]。

目前，糖尿病肾病的诊断还没有统一的标准，尿中白蛋白排泄增加是糖尿病肾病的主要特征之一，可以通过检测尿微量白蛋白帮助其在肾组织损伤的早期诊断[8]。

Parving等[9]采用放射免疫扩散法对23例长期胰岛素依赖性糖尿病人进行检测，结果病患组的尿MA都有一定程度的增高，其中有9例患者的尿MA平均值为115mg/d，而正常对照组的最高值为＜40 mg/d（P＜0.05）。

黄佳[10]采用放射免疫法对100例DM患者的尿MA进行检测，结果表明DM组约72%的人尿MA含量有明显的增高，而正常对照组的结果均＜7 mg/d（P＜0.001）。

另外，杨光等[11]对138例DM患者做晨尿微量白蛋白、血尿素氮、肌酐检测，结果，血尿素氮、肌酐检测患病组与健康对照组之间没有显著差异（P＞0.05），而尿微量白蛋白检测有显著差异（P＜0.01），说明尿MA可以做为诊断糖尿病肾病和肾功能损伤的指标之一。

1.2.2.2 Ⅱ型糖尿病(T2DM)合并冠心病患者尿MA检测的临床意义
尿微量白蛋白是早期诊断DN的重要依据，也是冠心病的独立预测因子[12]。

最近有报道，糖尿病患者心脏功能明显降低可能与其发生冠脉病变有关，而出现尿MA的T2DM患者与一般T2DM患者比较，其动脉血管内皮功能受损更严重，进一步导致左室射血分数更低，最终导致冠心病的发生[13]。

陈凯东[14]探讨了Ⅱ型糖尿病合并冠心病的危险因素，他将以确诊为Ⅱ型糖尿病的216例患者，根据是否合并冠心病分为A组102例和B组114例进行对照分析。

结果，两组患者年龄、性别、BMI、DBP、FBG、TC、GHb1c比较，无显著差异性（P＞0.05）；糖尿病病程、血压、尿微量白蛋白比较，A组明显高于B组（P＜0.05）。

因此，MA能作为T2DM合并冠心病的早期诊断标志。

1.2.2.3 尿MA检测在心血管疾病中的临床意义
自1974年Parving等[15]发现某些高血压病人的尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER）有明显增加之后，大量临床研究结果和流行病学资料证实了
UAER的高低与心血管疾病预后明显相关，MA与心血管疾病之间的关系受到人们的高度关注。

一些大型临床试验如MARV AL (microalbuminuria reduction with valsartan)试验和HOPE(the heartoutcome prevention evaluation study)试验等[16]表明，伴有微量白蛋白尿的高血压病人的心血管事件的发生率和死亡率较无蛋白尿者明显增加，而经血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)等药物治疗后，伴随着心血管事件发生率的明显降低，微量白蛋白尿也表现出下降趋势。

这一结果表明尿MA可以作为一项评价心血管疾病治疗效果及预后的指标，具有重大的意义[17]。

1.2.2.4 尿MA在系统性红斑狼疮(SLE)患者中的检测的临床意义
系统性红斑狼疮（systemic lupus eryhematosus, SLE）是常见的自身免疫病之一，病变能累及全身多个组织器官，包括关节、皮肤、肾、肝、心血管等部位和血细胞，尤其以肾脏受累最为常见和严重。

SLE患者起病5天就出现肾损害者占50%～90%，尽管近十年来随着肾炎治疗的进展，狼疮肾炎(LN)患者生命得以大大延长，但肾炎仍为SLE患者死亡的主要原因[18]。

若能早期观察肾脏受损程度，进行早诊早治，从而改善SLE患者预后，降低病死率。

贾支俊、冯雪凤等[19]人对524例SLE患者的尿液微量白蛋白进行检测，结果发现病程＜5年的SLE患者组的尿MA含量均出现明显异常，病程5～10年和＞10年组与正常组相比较有明显差异(P＜0.05)。

因此，尿MA可作为SLE肾损伤的早期指标之一。

尿MA与尿α1微球蛋白(α1-MG)、尿β2微球蛋白(β2-MG)及尿免疫球蛋白G( IgG)等其他微量蛋白共同检测，能反映SLE患者肾小球和肾小管双重损害程度，是SLE患者早期肾损害最敏感的指标。

综上所述，尿MA的检出不仅是DN的早期表现，也是高血压、心血管疾病的独立危险因素，随着医学技术的发展，它会被越来越多的应用于临床的各个领域。

1.2.3 尿微量白蛋白检测方法的进展
1.2.3.1 尿样的选取方法
目前，尿微量白蛋白检测的尿样的选取存在三种方法：定时取尿法、随机留尿法和24小时留尿法[20]。

定时取尿法：通常的作法是留取临睡前至次晨这一时间段的尿样本进行检测。

临睡前排尿、弃去此次的尿样本，并准确记录时间，以后每次夜间排尿均留取尿样本，存于样本收集容器中，清晨排尿、留取样本、准确记录时间。

将容器中的尿样本混匀，准确记录尿量，取出一杯尿，送检。

检测者将根据尿白蛋白的浓度、尿量及留取尿样的时间计算出每分钟的尿白蛋白排出率。

因此，准确记录留尿的时间和尿量对于获得准确的结果是很重要的。

24小时留尿法：留取24小时的尿样本，同时可计算肌酐清除率及24小时尿白蛋白排泄率。

随机留尿法：随机留取一次尿样本，同时检测尿中的白蛋白及肌酐的浓度，用肌酐比值报告尿白蛋白排出率。

上述三种方法中，24h尿mALB排泄率（24h-urinary albumin excretion rate，
24h-UAER）是诊断糖尿病肾病的金标准，但因操作繁琐，临床利用率不高。

检测单次晨尿或随机尿，因其分析方法简便，广泛应用于临床和科研中。

由于尿样标本复杂，后两种方法能否代替24h-UAER，目前尚缺乏科学评价[21]。

但对于后两种方法对DN的诊断试验的有效性，马清光等[22]人作了相关报道，他利用计算机检索系统，对国外和国内关于“尿微量白蛋白，糖尿病肾病”进行统计，分析晨尿和随机尿两种取尿方法诊断糖尿病肾病的有效性，结果这两种方法的有效性都很高，两者之间差异无统计学意义。

1.2.3.2 尿微量白蛋白的检测方法
尿微量白蛋白作为糖尿病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对其检测方法的研究越来越受到关注。

目前应用于尿微量白蛋白检测的方法有很多：
（1）RIA法
放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）是Yalow RS和Berson SA于20世纪五十年代创建的，随后广泛用于各种物质的检测，Jury DR等[23]将该法用于检测尿微量白蛋白。

实验原理是用125I标记抗原，然后将125I标记抗原(Ag*)和非标记的待测抗原(Ag)对限量的抗人血清白蛋白抗体(Ab)进行直接竞争性抑制反应。

Ag*―Ab复合物与游离Ag*的分离采用双抗体法，即第一抗体为兔抗HSA抗体, 第二抗体则为羊抗兔IgG抗体, 而且二者可混合在一起作为单一试剂应用，该方法的灵敏度为1 mg/L；另外Mohamed A 等[24]用聚乙二醇6000为沉淀剂，通过离心分离Ag*―Ab复合物与游离Ag*，省去了制备第二抗体的麻烦，该方法的灵敏度为1.3 mg/L。

该方法灵敏度高, 特异性强, 但是放射性同位素对人体健康有一定危害，且需要特殊的仪器设备。

目前, 此方法作为衡量其他尿微量白蛋白检测试剂盒的参考标准。

（2）免疫比浊法(IT)
免疫比浊法（immunoturbidimetry，IT）主要包括两类：一类为免疫透射比浊法，另一类为免疫散射比浊法。

前者是测定光线通过抗原抗体复合物溶液时的透射光的强度；后者是以激光作光源，测量溶液中抗原抗体复合物的散射光强度。

前者使用普通的分光光度计就能测定，而后者需用特殊仪器―激光比浊计，但其灵敏度大大高于前者。

Watts等[25]用适当的缓冲液将尿样稀释后，与兔抗HSA抗体反应，然后直接在分光光度计上以340nm波长测定2min内吸光度的变化值，其灵敏度为2.0mg/L。

Marre等[25]以激光作光源，在Behring激光比浊计上测定MA，在设定的时间内能连续读数和自动分配标准、样品和抗血清，通过计算机直接计算出白蛋白含量，每小时可测定240个样品，该法的检测范围为0.34～430mg/L，此法较RIA法简便快速，且避免了放射性同位素标记白蛋白的危害。

（3）FIA法
该法最早用于定量检测MA是Silver[27]，他用异硫氰酸荧光素（FITC）标记标准的白蛋白抗原，然后和未标记白蛋白样品对限量的抗白蛋白抗体呈竞争性抑制反应，这样最后荧光强度与样品中的MA含量呈负相关，而FITC标记抗原抗体复合物和游离抗原
的分离采用双抗体法。

该法灵敏度12.5mg/L，平均回收率101%，CV4.5～8.2%，与RIA 比较，r=0.983。

（4）酶联免疫吸附法（ELISA）
4.1 双抗体ELISA Watts等[25]应用此法测定尿微量白蛋白。

他所用的两个抗体来源于同一个宿主，将抗体纯化后一部分包被在固相载体上作为捕获抗体，另一部分用辣根过氧化物酶标记作为检测抗体，这样形成“抗体-抗原-抗体”结构的复合物，最后加入邻苯二胺―过氧化氢底物液显色，测定420nm波长的OD值，同时制作标准曲线，该法灵敏度6.25μg/L, 回收率和重复性良好。

4.2 竞争性ELISA Chesham等[28]创建此法检测尿MA，用标准的HSA包被固相结合板，然后依次加入标准液或样品，HRP标记的抗HSA抗体，使包被抗原与未包被抗原对限量的酶标抗体呈竞争性抑制结合，全部操作可在1h内完成。

本法检测灵敏度为0.8mg/L，与FIA法相关性好，r=0.96。

Van Kamp等[29]报道，在传统的洗绦液和稀释液中加入酪蛋白可提高检测的灵敏度，该法灵敏度为0.6mg/L，与散射比浊法相关性良好，r=0.98。

另外，J.C.Townsend等[30]用交联剂将HSA和牛甲状腺球蛋白结合在一起形成复合物，包被在固相载体上，以提高ELISA灵敏度。

本法灵敏度为0.5mg/L，与RIA法比较，r=0.95。

（5）时间分辨免疫荧光法（TRFIA）
该方法是近几年发展最快的一种免疫检测方法。

Nisbet等[31]用人血清白蛋白与铕鳌合剂―异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕（Ⅲ）（DTTA-Eu）孵育过夜，经Sephadex G-200纯化后，获得一种每分子人血清白蛋白与5个原子铕结合的标记物。

用纯化的羊抗兔IgG包被微孔板，然后加入尿液，铕标记的人血清白蛋白及兔抗人血清白蛋白抗体，铕标记人血清白蛋白和未标记MA对兔抗人血清白蛋白抗体呈竞争性抑制结合，最后每孔加入荧光增强剂（FES），所释放出的荧光用荧光计测定。

该法灵敏度3.0mg/L，回收率97～112%。

该法是临床实验室测定尿MA的一种有发展前途的方法。

（6）共振散射光谱法（RS）
该方法是近年发展起来的定量检测蛋白的方法。

梁爱惠、蒋治良等[32]报道了一种免疫共振散射法快速检测Alb，在pH4.4的缓冲液中，PEG的存在下，Alb与山羊抗HSA 抗体组成的免疫复合物能发生聚合，并且该聚合物在488nm处有最大共振散射峰，散射光强度与Alb的浓度成比例。

该方法与IT试剂盒检测结果一致，测定范围0.03～0.96mg/L，最低检测限为0.02mg/L。

（7）溴酚蓝染料结合法
卜竞舟等[33]报道了用溴酚蓝测定MA，利用康宁-560自动生化分析仪采用终点法测定，结果，最低检出率为5mg/L，线性范围为5～500 mg/L，批内CV为0.5%～5.8%，批间CV 0.6%～6.5%。

回收率96%～102%。

与免疫比浊法的相关系数r=0.970，尿中常见物质及临床常用药物均无明显干扰。

正常参考范围5～45mg/L。

可在自动生化分析仪上测定和用目视比色半定量测定尿微量白蛋白。

（8）化学发光法
赵丽霞等[34]基于生物素-亲和素系统和FITC-抗FITC系统建立了化学发光ELISA法检测MA，作用底物是吖叮酯类物质。

该方法的灵敏度为0.089 mg/L，测定范围为0.15～15 mg/L，与RIA有很好的相关性。

综上所述，RIA、IT、FIA、ELISA和RS等方法灵敏度高，特异性强，但需要一定的仪器设备，且操作繁琐，不能广泛推广；溴酚蓝染料结合法操作简便，不需特殊仪器设备，但灵敏度不强，适合MA的初步大范围的筛选工作；TRFIA和化学发光法，灵敏度高，特异性强，是近年免疫检测中最有发展前途的方法。

1.3 抗体制备技术
1.3.1 抗体简介
抗体（antibody）是机体在抗原刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

每个B淋巴细胞含有合成一种抗体的遗传基因。

动物脾脏中有上百万种不同的B淋巴细胞系，能合成上百万种不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的不同的决定簇分别激活具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。

一般制备抗体的方法是通过免疫动物并采集动物的抗血清，因而这种制备的抗体通常含有针对其他杂抗原的抗体和血清中其他杂蛋白质成分。

按这种方法制备的抗血清就是不同B细胞克隆产生的异质抗体的混合物，它又被称为多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

如果能选出一个专门分泌一种特异抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群。

这种单克隆细胞将合成针对一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）[35]。

常规免疫血清抗体与单克隆抗体的比较见表1-1。

表1-1 常规免疫血清抗体与单克隆抗体的比较
项目常规免疫血清单克隆抗体产生抗体的细胞多个克隆单个克隆
IgG类别及亚类多种类属同一类属
识别抗原决定簇的能力特异性识别多种特异性识别单一特异性与亲和力各批次之间不同特异性强，抗体均一有效抗体含量低高
用于常规免疫学实验可用单抗组合应用沉淀反应容易形成一般难形成
1.3.2 杂交瘤技术
单克隆抗体技术是在杂交瘤技术的基础上发展的。

1975 年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，其基本方法是把突变使失去合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与免疫了绵羊红细胞的小鼠脾脏细胞进行融合[36]。

使用的融合剂是仙台病毒，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的选择培养基（HAT）中生长进行筛选。

在这个复杂的细胞群体里，没有发生融合反应的HGPRT基因缺失的骨髓瘤细胞以及彼此融合的这类骨髓瘤细胞在HAT选择培养基中不能存活，而没有发生融合的正常脾细胞和彼此相互融合的脾细胞含有HGPRT基因，能但利用HAT培养基而生长，但它本身并不是无限繁殖的，所以只能在培养基中存活几天。

通过这样的筛选，只有脾细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞，由于得到了分别来自亲本脾细胞的HGPRT基因和骨髓瘤细胞能连续传代的特性，而在HAT培养基中能够存活下来。

最终这个实验得到了能分泌抗绵羊红细胞抗体的杂交瘤细胞系。

用得到的细胞系注射到小鼠腹腔，一段时间能长出杂交瘤，同时在腹水中能产生大量的性质均一的抗体，也就是后来所谓的单克隆抗体[37]。

该技术建立起来后，在很多科学家的努力下，在所用融合剂和骨髓瘤细胞系等方面得到了优化。

最开始使用的融合剂是仙台病毒，后来发现分子量为1000～4000的聚乙二醇（PEG）有更好的融合效果，且避免了病毒的污染，逐渐成为近代微生物细胞融合技术中广泛使用的融合剂；对于融合用的骨髓瘤细胞系，也在原始骨髓瘤细胞系MOPC-21等的基础上开发了SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1等，它们经过基因改造后既不合成轻链又不合成重链，由它们产生的杂交瘤细胞系所分泌的抗体是只针对目标抗原的同质抗体，再后来又建立了实用于大鼠、鸡等宿主的骨髓瘤细胞系，其基本原理和方法与小鼠的一样。

其制备基本原理示意见图1.1。

图 1.1 单克隆抗体的制备过程
1.4 荧光免疫分析技术
1950年Coons合成异硫氰酸荧光素，用作标记抗体做小鼠组织切片染色，开创了免疫荧光技术，又称为荧光抗体技术[38]。

由于将抗原、抗体的反应特异性与荧光的敏感性结合起来，因此，广泛应用于生物学、医学、免疫学等领域，它分为传统的免疫荧光技术和现代免疫荧光技术。

传统的免疫荧光技术是用异硫氰酸荧光素、罗丹明标记特异性抗体，对组织切片、细胞、细菌、病毒等物质作固相荧光染色，在荧光显微镜下分析荧光状态、分布[39]。

该技术及以后在此基础上发展起来的流式细胞仪和荧光偏振分析至今仍广泛用于临床诊断和基础研究。

现代免疫荧光技术实际就是时间分辨荧光技术，它利用具有独特荧光特性的镧系元素（主要是Eu）及其螯合物作为示踪物，标记蛋白质、DNA、细胞膜受体、复合抗体、亚细胞分子等。

采用先进的仪器，如荧光激活细胞分类仪、荧光自动化分析测试仪、单克隆荧光技术电子计算机图像显示仪等，对被分析对象作出准确的定性和定量[40]。

将荧光法引入免疫分析主要是因为它与分光光度法相比较具有高的灵敏度，其灵
敏度是分光光度法的100-1000倍。

另外，荧光测定可以把荧光激发波长、荧光发射波长、荧光寿命、偏振等参数同时结合起来，形成特异而多样的分析系统。

免疫荧光分析的应用范围非常广泛，如临床、农业、环境科学、食品及卫生等。

（1）免疫荧光分析在临床医学方面的应用传统的免疫荧光法包括：直接免疫荧光和间接免疫荧光，已深入应用于诊断学和生理学研究，借助荧光显微镜判定检测结果，如阴道毛滴虫的检测[41]。

另外，应用时间分辨免疫荧光法可以检测血清叶酸和维生素B12的含量，从而探讨其与各种疾病的相关性[42]；还可以定量检测生物流体中的不同药物，其中包括酰胺咪嗪和安卡西林[43]。

（2）免疫荧光分析在核酸研究中的应用实验室检测发展最为迅速的一个领域是核酸诊断学。

在这些实验中，核酸作为目标物，通过检测互补DNA标记序列来研究它们。

若目标物序列与DNA探针定性或定量检测。

荧光原位杂化(FISH)是在放射原位杂交技术和免疫荧光技术的基础上发展起来的，它的基本原理是将DNA 或（RNA）用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体上，再用荧光素标记的单克隆抗体与探针分子特异结合来对DNA序列进行定位、定性和定量分析。

利用FISH技术来研究癌症患者的肿瘤抑制基因，近来在肿瘤细胞遗传学的文章中多有报道[44]。

（3）免疫荧光分析在食品安全中的应用当今社会，人们对食品安全的要求越来越高，对各种污染物的即时、准确的检测是必须的，免疫荧光技术在其中也得到了广泛的应用。

如沙门菌和埃希氏大肠杆菌的检测，各种生物毒素的检测及有含金属的检测。

采用时间分辨免疫荧光技术，使这些物质的检测灵敏度是ELISA方法的10倍以上[45]。

荧光光谱飞速发展并扩展到了新的研究和应用领域，传统意义上，荧光用于分析测定，用于临床备受关注的分析测定的例子已层出不穷。

荧光免疫测定作为少数几个可替代放射性同位素免疫测定的技术之一，现在应用越来越广泛。

当无需很高的灵敏度时，荧光组化免疫测定可以发挥很大的优势；若灵敏度至关重要，可使用时间分辨免疫荧光测定。

作为灵敏度最高的方法之一，时间分辨免疫荧光测定已越来越多的用于病原体的核酸诊断。

显而易见，在传统领域中，荧光光谱飞速发展，在新的领域中，荧光光谱也有着广阔的发展前景和应用价值。

1.5 酶联免疫分析技术
酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA）最早由Engvall 和Perlmann与Van Weeman 和Schuurs[46]同时建立。

经过三十多年的发展，ELISA技术已经日趋成熟，应用也越来越广泛。

1.5.1 ELISA基本原理
ELISA方法建立的基础包括两个方面：第一，抗原抗体的固相化结合；第二，抗原或抗体的酶标记。

结合于固相载体的抗原或抗体其本身的免疫学活性并没有受到限。