一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510886138.0
(22)申请日 2015.12.04
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/76(2006.01)
C12P 13/02(2006.01)
C12R 1/465(2006.01)(71)申请人南京工业大学
地址210009 江苏省南京市新模范马路5号
(72)发明人徐虹 曹长虹 冯小海 许召贤
许宗奇 徐铮 徐得磊
(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所
(普通合伙) 32204
代理人肖明芳
(54)发明名称
一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与
应用
(57)摘要
本发明公开了一种小白链霉菌基因工
程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将
来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运
蛋白基因amtB 进行过量表达，具有比白色
链霉菌S.albulus PD-1更高的聚赖氨酸
(ε-poly-L-lysine,ε-PL)合成能力。

所述的铵
转运蛋白基因序列如SEQ ID No:1所示。

本发明
还公开了上述重组菌的构建方法与发酵验证。

其
利用amtB 的高效表达，消除因铵载体不足带来的
限制，提高S.albulus PD-4对发酵液中氮源的利
用率，从而提高ε-PL 的产量，降低生产成本，带
来巨大的经济利益。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书5页序列表3页 附图1页CN 105441373 A 2016.03.30
C N 105441373
A
1.一株小白链霉菌基因工程菌，其特征在于，它是将铵转运蛋白基因在Streptomyces albulus PD-1中过量表达铵转运蛋白基因，所述的铵转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.根据权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述的Streptomyces albulus PD-1为CCTCC NO:M2011043。

3.权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以S.albulus PD-1的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示核苷酸序列为引物，PCR扩增得到铵转运蛋白amtB的核苷酸序列，将该核苷酸序列与pIB139质粒连接，得到重组质粒pIB139-amtB；
(2)接合转移法将所述的表达载体整合入白色链霉菌S.albulus PD-1染色体，获得所述的工程菌；
(3)抗性培养基筛选阳性克隆：在含有硫酸安普霉素的培养基上生长出的菌落为阳性克隆，即得到小白链霉菌基因工程菌。

4.权利要求1所述小白链霉菌基因工程菌在制备ε-PL中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵过程中，培养基中C/N比为2～23：1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵温度为28～32℃。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵时间为6～8天。

权　利　要　求　书1/1页CN 105441373 A
一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株聚赖氨酸发酵菌株及该菌株的构建方法与应用。

背景技术
[0002]ε-PL是日本的S.Shima和H.Sakai两位博士1977年在大量筛选生物碱物质时首次发现的一种新型聚氨基，ε-PL是由L-赖氨酸的α-羧基和ε-氨基之间形成的酰胺键聚合而成的聚阳离子，作为天然型的聚氨基酸，ε-PL具有优良的生物相容性和生物降解性，其分子侧链含有大量的亲水性游离氨基，便于对其进行功能化改造，因而ε-PL在保健食品、基因载体、药物缓释、生物医学材料等领域具有广阔的开发和应用前景。

生物法合成聚赖氨酸以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前ε-PL工业化生产比较经济有效的方法。

[0003]ε-PL属于次级代谢产物，在聚赖氨酸的代谢过程中，发酵周期一般需要6-8天，发酵产物ε-PL是一种含氮量较高的化合物，聚合物单体上含有两个氨基，其合成与菌体细胞内的氮素代谢有密切联系，发酵液中的氮素被细胞摄取分解为氨、铵离子(NH4+)或谷氨酸作为合成产物的重要原料，我们猜想提高氮素的供给有可能提高细胞内氮源的供给，从而提高ε-PL合成。

[0004]随着分子生物学的发展，利用分子克隆和外源表达及基因过量表达技术可以大幅度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量。

铵转运蛋白是一类存在于细胞膜上主动转运NH4+的载体，普遍存在于真核生物或原核生物细胞膜上，可将细胞所处环境中的铵离子转运到细胞内，确保微生物氮代谢的正常运行。

铵离子转运蛋白的研究主要集中在大肠杆菌、酵母中，但在放线菌中的相关报道却很少。

发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是，提供一株小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株。

[0006]本发明还要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株的构建方法。

[0007]本发明最后要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株在产聚赖氨酸中的应用。

[0008]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009]一株小白链霉菌基因工程菌，其特征在于，它是将铵转运蛋白基因在Streptomyces albulus PD-1中过量表达铵转运蛋白基因，所述的铵转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

[0010]所述的Streptomyces albulus PD-1为CCTCC NO:M2011043，其分类命名为其分类命名为链霉菌(Streptomyces albulus)，菌株号PD-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011043，保藏日期：2011年2月21日，地址：武汉大学，
邮编430072。

该菌株的详细信息已经在申请号为201110049986.8的中国专利中公开。

[0011]上述小白链霉菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)以S.albulus PD-1的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示核苷酸序列为引物，PCR扩增得到铵转运蛋白amtB的核苷酸序列，将该核苷酸序列与pIB139质粒连接，得到重组质粒pIB139-amtB；
[0013](2)接合转移法将所述的表达载体整合入白色链霉菌S.albulus PD-1染色体，获得所述的工程菌；
[0014](3)抗性培养基筛选阳性克隆：挑取10个单克隆于5mL含有50μg/mL硫酸安普霉素的M3G液体培养基中，30℃、200rpm培养3天后提基因组，用硫酸安普霉素引物进行PCR，根据电泳结果判断：含有与apr基因相同大小DNA片段的菌落为阳性克隆，对阳性克隆子进行复壮培养，得小白链霉菌基因工程菌S.albulus PD-4。

[0015]上述小白链霉菌基因工程菌在制备聚赖氨酸中的应用。

[0016]其中，发酵过程中，培养基中C/N比为2～23：1，培养基中的碳源为葡糖糖等，氮源为硫酸铵等。

[0017]其中，发酵温度为28～32℃。

[0018]其中，发酵时间为6～8天。

[0019]有益效果：本发明选择一株小白链霉菌S.albulus PD-1作为分子生物学操作的出发菌株。

通过PCR技术从S.albulus PD-1菌株的基因组上扩增得到了铵转运蛋白基因(amtB 基因)，成功构建了能够高效过量表达铵转运蛋白基因的工程菌。

该重组菌可以在较低浓度的氮素浓度下仍能高效利用氮素合成更多的ε-PL，减少氮源浓度过高导致的胞内酶系受阻，相关酶活性受限，发酵过程中维持1g/L的NH4+至发酵终点，S.albulus PD-4经补料发酵产量可达35.7g/L，较对照组S.albulus PD-1明显提高，菌体干重最终达到32.3g/L，较对照组也有好大的提高，从发酵角度进一步证实铵离子转运蛋白的引入可以更好的提高发酵液氮素的利用，使S.albulus PD-4在较低浓度的铵态氮浓度下仍能很好的合成ε-PL，有效解决了发酵过程中因氮素供给上引起的的问题，有良好的工业应用前景。

附图说明
[0020]图1为E.coli ET12567(pIB139-amtB)的双切图谱及重组菌PCR验证。

[0021]图2为amtB基因的导入对S.albulus PD-4中ε-PL产量的影响。

[0022]图3为5L发酵罐中S.albulus PD-1(3-A)、S.albulus PD-4(3-B)补料分批发酵比较。

具体实施方式
[0023]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0024]出发菌株小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC M2011043)已经在申请号为201110049986.8的中国专利中公开。

[0025]实施例1：铵转运蛋白基因(amtB基因)的克隆和基因工程菌的构建。

[0026] 1.1 PCR扩增铵转运蛋白基因(amtB基因)。

[0027]用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)提取处于对数生长期的S.albulus PD-1的基因组DNA，并用2％(20g/L)的琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进行检测。

[0028]运用Vector NTI软件设计下列两条引物：
[0029]引物1：5′-CCATATGGCATATGGTGAACCTCTCAGGTTCCGATGA-3′
[0030](下划线处为Nde I酶切位点)
[0031]引物2：5′-CTCTAGAGAGATCTCTACTTCTGCCGCTTGTAGAAGG-3′
[0032](下划线处为Xba I酶切位点)
[0033]以获得的S.albulus PD-1的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。

[0034]PCR体系：基因组DNA 2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP 2μL，10×exTaq缓冲液(含Mg2+)2.5μL，exTaq酶0.5μL，DMSO 2μL，ddH2O 14μL；
[0035]PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，然后58℃退火45s，72℃延伸1.5min，循环35次，最后72℃延伸10min；
[0036]2％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论：与预期分子量(1188bp)大小相符。

因为无杂带，所以用DNA纯化试剂盒回收。

[0037] 1.2限制性酶切反应，纯化及连接反应。

[0038]对实施例1.1获得的PCR产物用对应的酶进行双酶切反应。

本实验中，所用的限制性内切酶是Nde I和Xba I。

酶切体系为：PCR产物12.5μL，Nde I 0.5μL，Xba I 0.5μL，10×缓冲液2.5μL，ddH2O 9μL，总体积25μL。

将DNA纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物。

[0039]同样的用限制性内切酶是Nde I和Xba I对pIB139质粒进行酶切,线性化后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒纯化即可。

[0040]连接经过纯化后的PCR产物和pIB139线性化质粒进行。

连接体系为：酶切纯化的PCR产物4.5μL，酶切纯化的pIB139质粒0.5μL，Slolution I 5μL。

在37℃过夜连接获得重组质粒pIB139-amtB，转化至大肠杆菌E.coli ET12567中。

挑取单菌落进行提质粒，对其进行按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用Nde I和Xba I进行单-双酶切，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，图1中泳道1指出的amtB基因条带，证实了重组质粒pIB139-amtB的成功整合。

[0041] 1.3重组菌的构建，采用大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的方式。

[0042](1)挑取含重组质粒pIB139-amtB的大肠杆菌E.coli ET12567单菌落于LB培养基中(含25μg/ml的卡那霉素，25μg/ml的氯霉素和50μg/ml的安普霉素)，37℃振荡培养过夜；[0043](2)按2％接种量，将活化过夜的重组大肠杆菌E.coli ET12567(pIB139-amtB)转接于新鲜的LB培养基中(含卡那霉素、氯霉素和安普霉素)，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，离心，用等体积的LB培养基洗涤菌体两次，重悬于0.1倍体积的LB培养基中；
[0044](3)处理重组E.coli ET12567(pIB139-amtB)的同时，取约108个小白链霉菌孢子于500ul 2×TSB培养基中，50℃热激10min后冷却；
[0045](4)取500μl重组E.coli ET12567(pIB139-amtB)与等体积热激处理的孢子悬液混匀，轻悬，去除大部分上清后，将混合的细胞重悬于剩余的液体中；
[0046](5)将混合细胞涂布于含10mM MgCl2的MS固体培养基中，30℃培养16-20h；
[0047](6)涂布1mL无菌水(含0.5mg萘啶酮酸和1mg硫酸安普霉素)覆盖平板，30℃继续培养至长出转化子。

[0048] 1.4阳性克隆筛选
[0049](1)挑取转化子于MS培养基上(含25μg/ml的萘啶酮酸和50μg/ml的硫酸安普霉素)进行反复筛选。

[0050](2)液体培养基中活化得到各种转化子，提取各转化子的基因组DNA，用硫酸安普霉素抗性基因(apr基因)引物进行PCR，产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，图1中泳道2指出的apr基因条带，证实了重组质粒pIB139-amtB的成功整合。

[0051](3)所得重组菌命名为Streptomyces albulus PD-4。

[0052]实施例2：高效氮源利用重组菌摇瓶发酵验证。

[0053]配制种子液100mL，培养基为M3G液体培养基(Glucose 50g/L，Yeast Extract 5g/ L，(NH4)2SO4 10g/L，K2HPO4 0.8g/L，KH2PO4 1.36g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O 0.04g/L，pH 6.8)，经121℃高压湿热灭菌15min后装入500mL广口三角瓶中。

用接种环向种子液接入一环基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，并置于30℃摇床以200rpm的转速过夜培养3天。

发酵结果如图2所示，摇瓶发酵三天产量达到ε-PL 1.38g/L，单位体积的菌体干重(DCW)可达7.2g/L，S.albulus PD-1对照可达1.23g/L，DCW可达6.5g/L。

相比对照，ε-PL提高了13％，DCW提高了10.8％。

[0054]实施例3：高效氮源利用重组菌摇瓶两阶段发酵优化C/N。

[0055]将工程菌S.albulus PD-4和对照菌S.albulus PD-130℃200rpm培养一天后，6000rpm，离心5min，收集菌体，洗涤后转接至葡糖糖浓度10g/L，硫酸铵浓度不同的培养基I 中，控制C/N在2.36:1，3：1，4.71:1，9.17:1，11.5:1，16.5:1，23:1继续发酵7天，发酵结束取样测定ε-PL产量，发酵结束发现，如表1所示，原始菌株在摇瓶两阶段发酵过程中最佳C/N为3:1时ε-PL达到最大，最大值1.236g/L,原始的补料工艺下供给S.albulus PD-1一定浓度的葡萄糖和硫酸铵，C/N供给可基本维持在3:1，这与以往的研究一致；而工程菌在摇瓶两阶段发酵过程中最佳C/N为4.71:1时ε-PL达到最大，最大值1.475g/L，且C/N为3:1时的产量也高于对照组，说明铵离子转运蛋白的引入，使得S.albulus PD-4对氮素的利用发生了改变，S.albulus PD-4可以在较低浓度的氮源下仍能高效利用氮素合成更多的ε-PL，最优C/N为4.71:1。

[0056]表1不同C/N对ε-PL摇瓶两阶段发酵的影响
[0057]
[0058]实施例4：最优C/N流加方式下5L发酵罐发酵。

[0059]将工程菌S.albulus PD-4和对照菌S.albulus PD-1在同等条件下进行5L发酵分析，发酵实验的条件为30℃，转速400r/min，发酵7天。

发酵过程中葡萄糖浓度维持在10g/L，当NH4+浓度降至一定值时，控制S.albulus PD-4发酵过程NH4+浓度控制在1g/L，尽可能的维
持最优C/N为4.71:1，控制S.albulus PD-1发酵过程NH4+浓度控制在1.5g/L，尽可能的维持最优C/N为3:1，发酵结束对ε-PL产量、菌体干重等参数进行分析，如图3所示(图3中Resudial G表示残糖)，S.albulus PD-4经补料发酵ε-PL产量可达35.7g/L，较对照组S.albulus PD-1明显提高。

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图1
图2
图3
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