生化实验：实验六__过氧化氢酶米氏常数(Km)的测定-戴婷

③底物浓度［S］=②÷4 0.01
2 1.00 0.08
⑤剩余H2O2mmol=④ ×0.004×5/2
1.35 0.0135
3.70 0.037
⑥反应速度V=②一⑤
0.0265 0.043
⑦ ［S］/V= ③/ ⑥
0.377 0.465
3 1.50 0.12 0.03 6.40 0.064
哪些操作？
一、实验目的
掌握Km值的概念意义，作图求Km的常用方法。 掌握过氧化氢酶Km测定的原理及操作方法。
二、实验原理
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：
2H2O2→2H2O+O2↑ H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测 知。
2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 → K2SO4＋5O2↑＋8H2O
最后用0004mollkmno滴定各瓶至微红色记录kmnomol浓度加入的毫升数kmno0004moll消耗的kmno毫升数52反应中mol换算系数下面引用一次实验结果为例求过氧化氢酶的km值供计算参考
实验七 过氧化氢酶米氏常 数（Km）的测定
※反应速度与底物浓度关系：
米－曼氏方程式，米氏方程式
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换 算系数）
2．求Km值： 下面引用一次实验结果为例，求过氧化
氢酶的Km值，供计算参考。 己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2
浓度为0.08mol/L，列表计算如下：
计算程序 ①加人H2O2数
1 0.50
②加人H2O2mmol=①×0.08 0.04
最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微 红色，记录KMnO4消耗量(ml)。
四、计算
1.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的 H2O2 mmol数
即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－ KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数 × 5/2
加入物(ml)
1 23 4 5
H2O2(约0.05mol/L) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
蒸馏水
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
血液稀释液
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
25％硫酸
37度保温5分钟 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
0.004mol/L 高锰酸钾
依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml， 边加边摇，反应时间5min，按顺序向各 瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶 促反应立即终止。
2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各 加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和 25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求 出H2O2的mol浓度。
3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形 瓶5只，编号，按下表操作。
0.056 0.536
4 2.00 0.16 0.04 9.80 0.098
0.062 0.645
5 2.50 0.20 0.05 13.20 0.132
0.068 0.735
按前述方法作图求得Km＝2.5×10-2mol/L。
五、思考题
l．Km值的意义是什么？ 2．测酶Km值的实验中，需要特别注意
[S]： 底物浓度 V： 不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-
Burk法）
1 Km 1 1 — = —— . — + ——
v Vmax [S] Vmax
2MnSO4＋
求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。
Hanes法求出过氧化氢酶的米氏常数。
三、操作步骤
l．血液稀释 :吸取新鲜（或肝素抗凝）血液 0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀 释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0， 0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。