质粒克隆

质粒克隆，转化及抽提操作流程
一载体酶切:载体切2-5 µg vector
1.在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至100 μl
DNA sample 3-5μg
10× Buffer 10 μl
Enzyme A 2 μl
Enzyme B 2 μl
O up to 100 μl
H
2
37℃或酶的最适温度, 120分钟,
2. Alkaline Phosphatase的去磷酸反应
直接在从中促反应液中加
10×Alkaline Phosphatase Buffer 12 μl
CIAP（10～30 U/μl） 1 μl
O 7 μl
dH
2
Total 120μl
37℃反应60分钟。

三纯化：苯酚法
a)加dH
O至350μl（目的是减少纯化损失）
2
b)加350μl苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提1次。

仔细取上
清，不要吸下层和中间蛋白质层。

取大约330μl
c)加330 （要与3.2以的量相等）氯仿/异戊醇（24：1）抽提1次。

取300μl上清。

（可能损耗15%）
d 添加30 μl的3 M NaOAC（10分之一体积）。

e 添加750 μl的（2.5倍量）冷95%乙醇，在-20℃下保冷30分钟。

f 12000转，4℃离心,15 min，回收沉淀，
g 用500 μl的70％冷乙醇（用95%制备）洗一次，12000转，4℃离心, 5 min
h. 弃上清，反扣管口在清互的滤纸上吸净残余的上清，空气干燥10-15分钟。

I. 用水或TE Buffer溶解沉淀z。

具体如下
2μg 20μl
3μg 25 μl
4μg 30 μl
5μg 35 μl
3.8 测OD,并在1%AGAROSE 电泳检测。

Note: 浓度需大于50ng/μl
二．连接
以下反应均在冰上操作。

在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至10 μl
酶切载体100 ng
待连接片断30-100 ng (载体摩尔数的1-3倍)
2× T4 RAPID ligase buffer 5 μl
T4 ligase (3U/μl) 1 μl
O up to 10 μl
H
2
22℃连接1小时，或是过夜
三．转化:
1.连接产物5μl, 加100 μl感受态细胞DH5α,
NOTE：如是质粒直接转化，通常只需要1 ng,，感受态细胞20 μl
2.混均置冰上, 30 min,
3.42度,热激60秒, 置冰上2 min 以上,
4.加入900 μl SOC培养液, 37度,180 RPM , 1 小时
5.取100 μl直接涂布于LB+ 50 ug/ml kan 的平板上
6.6000 RPM 离心, 3 分钟, 弃上清,
NOTE：若是质粒直接转化，无需离心，只需取5 μl-10μl直接铺板
7.加100 μl SOC 培养液, 混均, 每块平板取100 ΜL涂布于LB+ 抗
生素的平板上,
8.37 度, 12-18 小时,
NOTE：在使用AMP+时，时间长，可能会出现卫星克隆。

四．鉴定:
1.取5-10个单菌落, 分别加入20μl水中，
2.PCR鉴定: TOTAL 20 μl
Above sample 2 μl
10X PCR buffer 2 μl
25 mM Mg2+ 2 μl
10 mM dNTP 0.4 μl
Primer R 5 pmol/μl 1 μl
Primer R 5 pmol/μl 1 μl
Tag 酶（5U/μl）0.1 μl
dH2O 11.5 μl
94℃ 5 min
94℃ 30 s , 58℃ 30s，72℃ 1 min 35cycles；
72℃ 7 min ; 4℃ 1 min
1.agarose , 电泳检测。

3.取PCR鉴定阳性的克隆3个，4 ml LB +抗生素, 250 RPM, 37
度, 16-18小时
4.只抽其中的一个质粒,酶切鉴定相符后，送测序。