复合酶解法提取三七皂苷的实验研究

Extraction of Saponins in Panax notoginseng with Conbined Enzymolysis
LI Yuan- bo* , YIN Hu-i an, TANG Ming- lin, AN Lian- ying, ZHOU Lin
( Department of Chemical Engineering and Pharmaceutics , Chengdu University of Technology , Chengdu 610059, China)
取三七粉 30 g, 参照5中国药典62000 年版一部 附录 IO 流浸膏剂项下实验, 浸泡 24 h, 流速为 3 mL/ min#kg, 收集渗漉液, 定容至 500 mL 备用。 2. 1. 3 纤维素酶解法
取三七粉 10 g, 加入 50 mL 蒸馏水冷浸 24 h, 以 每克 生药加 入 15 U 的 量加 入纤 维素 酶, 调节 pH 415, 于 50 e 水浴酶解 2 h, 酶解期间时时搅拌, 酶解 后过滤, 药渣加入 70% 的乙醇回流两次, 过滤, 合并 滤液, 定容至 200 mL 备用。 2. 1. 4 果胶酶酶解法
º
»
x
8. 13
7. 94
7. 94
2. 33
21. 24
20. 84
21. 04
21. 04
8. 24
7. 99
8. 12
1. 54
17. 22
17. 70
17. 56
17. 49
8. 78
9. 46
9. 23
2. 87Байду номын сангаас
27. 72
28. 03
28. 51
28. 07
8. 64
9. 16
8. 90
Abstract: We took total content of saponins and extraction rate as index to study the advantages and disadvantages of five extraction method, including reflux , percolation, cellulase enzymolysis, pectinase enzymolysis and conbined enzymolysis. In order to optimize the extraction procedure, we adopted single- factor method and orthogonal experiment design( 4 factors and 3 levels) to determine the extraction condition.The optimal extract conditions are as fo1lows: 15 U Cellulase anzyme and 140 U pectinase enzyme for 1 g Panax notoginseng , enzymolysis temperature 50 e , enzymic treatment 2. 5 h at 4. 5 pH in 80% alcohol. The content of total saponins in the extraction solution is 12. 01% , and extraction rate is 35. 82% under these conditions. Key words: conbined enzymolysis; Panax notoginseng ; saponins; extraction procedure
的因素如酶解时间, 酶解 pH 值的最佳工作条件。 2. 2. 1. 1 酶解时间对提取液中皂苷含量和提取物 得率的影响
解 2. 5 h 后, 酶解已经基本完全, 延长酶解时间对提 取影响不大, 因此适宜的酶解时间为 2. 5 h。
将上述各种方法所得提取液按照样品溶液的含 量测定和提取物得率测定项下操作测定三七皂苷含 量和提取物得率, 结果见表 1。
4 90
天然产物研究与开发
2005 V ol1 17 No1 4
提取方法 Ext ract met hod
乙醇回流法 Reflux by Ethonol
渗漉法 Percolation 纤维素酶解法 Cellulase enzymolysis 果胶酶酶解法 Pect inase enzymolysis 复合酶解法 Conbined enzymolysis
2. 92
34. 52
33. 92
35. 32
34. 59
11. 38
10. 97
11. 17
2. 67
32. 01
32. 80
32. 40
32. 43
RSD% 0. 61 1. 41 1. 02 2. 03 0. 82
2. 2 提取工艺条件优选
2. 2. 1 单因素法 用单因素法考察交互影响相对较弱, 水平较多
煎煮过程中因三七药材含有大量的淀粉和多糖容易 糊化[ 3] ; 醇沉后由于沉淀的吸附作用皂苷损失较大, 因而提取率很低。渗漉法提取率较高, 操作简单, 提 取液所含杂质少, 但是 溶剂消耗过大, 提取周 期较 长。乙醇回流法方法简便, 工艺条件易于控制, 但提
收稿日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-10-29
2 结果与讨论
2. 1 提取方法比较 2. 1. 1 乙醇回流法
取三七粉 10 g, 加入 8 倍量 70% 的乙醇浸泡 30 min, 加热回流 1. 5 h, 过滤, 滤渣再加入 5 倍量 70% 的乙醇回流 1. 5 h, 过滤, 合并两次滤液, 定容至 200 mL 备用。 2. 1. 2 渗漉法
取三七粉 10 g, 加入 50 mL 蒸馏水冷浸 24 h, 以 每克生药加入 140 U 的量加入果胶酶, 余下操作同 纤维素酶解法, 合并滤液, 定容至 200 mL 备用。 2. 1. 5 复合酶解法
取三七粉 10 g, 加入 50 mL 蒸馏水冷浸 24 h, 以 每克生药加入 15 U 纤维素酶、70 U 果胶酶的量加入 复合酶, 余下操作同纤维素酶解法, 合并滤液, 定容 至 200 mL 备用。
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NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT
2005 Vol1 17 No. 4
复合酶解法提取三七皂苷的实验研究
李元波* , 殷辉安, 唐明林, 安莲英, 周 琳
( 成都理 工大学化工与制药系, 成都 610059)
摘 要: 以 三七提取液 中总皂苷 的含量和提 取物得率 为指标, 考察了乙 醇回流法、渗漉 法、纤 维素酶解法、果 胶 酶解法、复合 酶解法的 优劣, 并采用单因 素法和四因 素( 纤维素酶 用量、果胶酶用量、酶解 温度、乙醇浓度) 三 水 平正交设计法对复合酶解法提取工艺条件进行优选, 得到如下较理想的提 取工艺条 件: 纤 维素酶用量 为 15 U/ g ( 生药) 、果胶酶用量为 140 U / g( 生药) , 酶解 pH 值为 4. 5, 酶解温度为 50 e , 乙醇浓度为 80% , 提取时间为 2. 5 h。 所得三七提取液中总皂苷的含量为 12. 01% , 提取物得率为 35. 82% 。 关键词: 复合酶解法; 三七; 总皂苷; 提取工艺 中图分类号: R28412
* 通讯作者 Tel : 86-28-66161643; E-mail : leefb@ 126. com
取率较低。杨军宣[ 4] 等人研究了纤维素酶在三七皂
苷提取中的作用, 但未考虑复合酶对三七总皂苷提 取的影响, 也未进行工艺条件优选。由于三七水溶 性成分三七素是止血活性成分, 高温易分解, 因此三 七常以生粉入药, 但药粉容易沉淀或被其它药渣吸 附而损失, 吞服后有效成分溶出又比较缓慢, 从而降 低了药材的生物利用度[ 5] 。
精密称取干燥至恒重的人参皂苷 Rg1 标准品 5 mg 于 5 mL 容量瓶中, 加甲醇定容至刻度。精密量 取 10、20、40、60、80、100 LL 置 10 mL 具塞试管中, 水 浴挥干溶剂, 各加入新配制的 5% 的香草醛冰醋酸 溶液 0. 2 mL, 高氯酸 0. 8 mL 于 60 e 水 浴恒温 15 min, 立即置于冰水中冷却 5 min, 加入 冰醋酸 5 mL 摇匀, 放置 10 min, 以试剂 空白作参比于 545 nm 处 测定吸光度, 以吸光度( A) 为横坐标, 以皂苷对照品 溶液加入的体积数( LL) 为纵坐标绘制标准曲线, 回 归得方程: Y= 0. 4759 A + 0. 0038, R2= 0. 9994。 1. 2. 3 样品溶液的含量测定
1. 2 三七皂苷的含量测定[ 6, 7] 1. 2. 1 大孔树脂预处理
大孔树脂用丙酮浸泡三天, 然后 65 e 水浴中恒 温加热回流 18 h, 抽滤, 置于层析柱中用丙酮冲洗至 与水 1: 2 混合不产生沉淀, 用蒸馏水漂洗至无丙酮 味, 水浸泡备用。采用湿法装柱, 层析柱内径 1 cm, 树 脂高度 5 cm, 覆以少许脱脂棉, 加入中性氧化铝 0. 2 g, 再覆一层脱脂棉, 压紧, 蒸馏水冲洗至中性后备用。 1. 2. 2 标准曲线的制备
中药三七为五加科人参属植物三七( Panax notoginseng( Burk) F. H. Chen) 的干燥块根, 具有活血化 瘀, 消肿定痛, 止血而不留瘀等功效, 始载于本草纲 目, 为我国传统名贵中药材[ 1] 。三七不同生长部位 含有二十多种皂苷成分, 三七总皂苷具有增加冠脉 血流量, 保护脑组织, 扩血管和降压等作用[ 2] , 是三 七的主要有效成分之一。目前, 常用的提取方法有 水煎醇沉法、乙醇回流法和渗漉法。水煎醇沉法水
¹ 7. 76 8. 12 9. 46 8. 90 11. 26
表 1 提取方法比较结果
Table 1 The effect of extracing method on results
皂苷含量( % )
Saponin cont ent
º
»
x
RSD%
¹
提取物得率( % )
Extract ion rate
液移入 5 mL 容量瓶中, 定容至刻度。精密量取该样 品溶液 40 LL 于 10 mL 具塞试管中, 水浴挥干溶剂, 照标准曲线项下方法测定吸光度, 用回归方程计算 浓度。
1. 3 提取物得率的测定 精密量取各提取液 50 mL 于水浴上挥干, 然后
置恒温干燥箱中 105 e 烘 3 h 至恒重, 于干燥器中 冷却 0. 5 h 称重, 计算提取物得率。
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李元波等: 复合酶解法提取三七皂苷的实验研究艺研究
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1 材料和方法
1. 1 仪器和试剂 WFJ2100 型数显可见分光光度计( 尤尼柯仪器
有限公司) 。三七药材( 由本校中药房提供) , 人参皂 苷 Rg1 对照品( 由中国药品生物制品检定所提供) , 纤维素酶( 活性单位 \15 u/ mg, 由上海奥博生物制 品有限公司提供) , 复合果胶 酶( 活性单 位 \70 u/ mg, 由广东环凯微生物科技公司提供) , D101 大孔树 脂( 由天津骨胶厂提供) , 高氯酸、香草醛、冰醋酸均 为分析纯。
从级差结果可以推断出工艺条件a3b2c1d3提取液中皂苷含量最高但是该组合提取物得率较低由表3可以看出温度越高提取物得率越高同时a因素对皂苷含量影响最小从减小纤维素酶用量和增加提取物得率两方面考虑选择组合a2b2d3作为三七复合酶法提取的最佳工艺条件由于该组合没有包括在正交表内必须进行验证实验
天然产物研究与开发
精密量取各三七皂苷提取液 2 mL 于水浴上挥 至近干, 用蒸馏水溶解, 于 10 mL 容量瓶中定容至刻 度。取 5 mL 溶液移入已处理好的大孔树脂层析柱 中, 控制流速 0. 5 mL/ min, 先用 15 mL 蒸馏水冲洗, 水液弃去, 再以 30 mL、70% 的乙醇洗脱, 收 集洗脱 液于水浴中挥干, 残渣用甲醇溶解, 离心, 收集上清
针对以上问题, 本文作者将冷浸法与复合酶解 提取法相结合, 在显著提高三七总皂苷提取率和提 取物得率的同时, 使三七素等水溶性有效成分溶出, 保持三七止血而不留瘀的功效[ 2] ; 在工艺条件优选 中将单因素法与正交实验法相结合, 以三七总皂苷 的含量和提取物得率为指标, 用较少的实验次数对 影响提取的因素进行筛选, 优选出最佳的工艺条件。