农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

中国农业科学 2020,53(18):3638-3649
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.18.002
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得
龚强1,2，王轲2，叶兴国2，杜丽璞2，徐延浩1
（1长江大学农学院，湖北荆州 434025；2中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）
摘要：【目的】目前，国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种，基因依赖性严重，尤其是大麦的转化效率较低，并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。

建立高效、无筛选标记大麦遗传转
化体系，拓展大麦遗传转化的受体基因型，为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。

【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体，取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料，通过对培养基成分及培
养步骤优化，建立农杆菌介导的高效遗传转化体系，并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表
达载体pWMB123转化大麦，获得候选转基因植株，然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等
检测方法，在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。

【结果】在愈伤组织分化阶段，发现培养基
中添加1.0 mg·L-1 KT、0.5 mg·L-1 6-BA和0.05 mg·L-1 NAA明显促进愈伤组织分化。

在转基因植株生根阶段，发现
采用添加1.0 mg·L-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳，培养基中添加2.5 mg·L-1 CuSO4显著降低了
大麦转基因植株白化现象。

共转化了138个幼胚，最终获得14株大麦转基因植株，转化效率10.14%。

PCR、Bar
试纸条、GUS染色等检测证实，T0代转基因植株中均含有Bar，而仅有10株含有GUS，2个T-DNA的共转化效率为
71.43%。

选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株，对其自交后代进行检测，在BL8株系中筛选到2株只含GUS
而不含Bar的转基因植株，无筛选标记效率为6.9%。

在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴
定，发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合，进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因
植株。

【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株，提高愈伤组织分化效率和转基
因植株生根效率，降低转基因植株白化现象。

利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦，成功获得了无筛选标
记转基因植株。

关键词：大麦；遗传转化；无筛选标记；农杆菌介导法
Generation of Marker-Free Transgenic Barley Plants by
Agrobacterium-Mediated Transformation
GONG Qiang1,2, WANG Ke2, YE XingGuo 2, DU LiPu2, XU YanHao1
(1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei; 2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract: 【Objective】Genotype dependence is a very serious problem in barley genetic transformation in which Golden Promise has been mainly used. In addition, the transformation efficiency of barley is still very low in China. Moreover, the generation of marker-free transgenic barley plants is very important to the future commercialization of genetically modified barley
due to the considerably increased public concerns. It is necessary to establish an efficient genetic transformation system for
收稿日期：2019-11-15；接受日期：2020-03-09
基金项目：国家自然科学基金（31201212）
联系方式：龚强，Tel：133****1716；E-mail：*********************。

通信作者王轲，Tel：185****3117；E-mail：****************。

通信作者徐延浩，Tel：189****3866；E-mail：******************.cn
18期龚强等：农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得 3639
generating marker-free transgenic barley plants, expand available barley genotypes for genetic transformation, and provide technical
support for functional genomics study and breeding and potential commercialization of genetically modified varieties of barley.
【Method】The composition and auxin adding ratio in the medium used for barley transformation as well as culture regime was
optimized to establish an efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation system for barley using the immature embryos
approximately 14 days post anthesis of a good agronomic trait variety Vlamingh. A double T-DNA vector pWMB123 containing the
Bar gene and the GUS gene cassette was introduced into barley by Agrobacterium-mediated transformation to obtain marker-free
transgenic barley plants in T1 generation. 【Result】It is indicated that the shoot induction medium supplemented with 1.0 mg·L-1 KT,
0.5 mg·L-1 6-BA and 0.05 mg·L-1 NAA significantly promoted the differentiation ability of barley transformed calli. The adding of
2.5 mg·L-1 copper sulfate in shoot induction medium lightened the albinism of transgenic barley plantlets. Through the exploration of
different hormone ratios and medium components, it was found that the SM1 supplemented with 1.0 mg·L-1 IBA without other auxin
had the best rooting effect. A total of 138 immature embryos were transformed with Agrobacterium containing pWMB123 vector,
and fourteen transgenic barley plants were obtained with a transformation efficiency of 10.14%. Detection by PCR, Quick Stix strips
and histochemical staining assays confirmed that all T0 plants contained Bar gene, among which four plants did not contain GUS
gene. The co-transformation efficiency of the two T-DNAs is 71.43%. In the T1 populations derived from the four T0 transgenic lines
containing Bar and GUS genes, two transgenic plants with GUS gene and without Bar gene were screened out in line BL8, and the
efficiency for marker-free transgenic plants was 6.9%. The two foreign genes of Bar and GUS were identified to be integrated in
most T1 transgenic barley plants be multiple copies using Southern blot. It was further confirmed that BL8-15 and BL8-19 were
marker-free transgenic plants.【Conclusion】An efficient genetic transformation system mediated by Agrobacterium-mediated for
generating marker-free transgenic plants with healthy roots and less albinism were successfully established in barley.
Key words: barley; transformation; marker-free transgenic; agrobacterium-mediated
0 引言
【研究意义】大麦（Hordeum vulgare L.）是世界第四大禾谷类作物，约占禾谷类作物总产量的8%[1]。

大麦营养成分丰富，富含蛋白质、抗性淀粉、纤维素和维生素等，而且大麦抗旱、耐贫瘠、耐盐碱性能较强，适应性广，在应对恶劣环境化和土壤盐渍化等逆境胁迫方面有着重要意义。

目前，国内外大麦转基因研究大多以转化效率较高的品种Golden Promise为受体，利用其他商业化大麦进行转化难以获得转基因植株，或者转化效率很低，限制了大麦基因工程育种的步伐。

近几年，大麦高质量参考基因组序列和部分基因功能注释不断完善[2]，需要对大麦进行功能基因组研究。

另外，国内还未发现有关无筛选标记转基因大麦研究的报道。

因此，提高大麦的遗传转化效率，拓宽大麦遗传转化的基因型，建立大麦无筛选标记遗传转化体系，对于大麦基因工程改良和产业化种植具有重要意义。

【前人研究进展】长期以来，有关大麦遗传转化的研究较少，转化效率较低。

1994年WAN等[3]利用基因枪分别转化大麦Golden Promise幼胚、愈伤组织和小孢子，首次获得可育转基因株系。

TINGAY等[4]利用农杆菌介导法建立了大麦Golden Promise幼胚的转化体系，转化效率4.2%。

TRIFONOVA等[5]通过调整生长调节剂的种类、预培养时间和微损伤等方法，获得大麦转基因植株，转化效率1.7%—6.3%。

FANG等[6]将绿色荧光蛋白作为可视标记，以hpt作为筛选基因，利用农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚，转化效率3.4%。

TRAVELLA等[7]依据荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测结果，比较了农杆菌介导和基因枪介导对大麦转化效率和转基因拷贝数等的影响，发现农杆菌介导的转化效率是基因枪的2倍，且在利用农杆菌介导获得的转基因植株中目标基因表达稳定、沉默情况较少。

BARTLETT等[8]对农杆菌转化大麦后的再生过程进行了进一步优化，将hpt标记基因和luc荧光素报告基因转化大麦Golden Promise 幼胚，转化效率提高到25%。

HENSEL等[9]进一步研究了外植体不同处理方法和共培养条件等因素对大麦转化效率的影响，进一步提高了大麦Golden Promise 幼胚的转化效率（高达86.0%），商业化春性大麦品种Optic、Helium和冬性大麦品种Igri、Tafeno等的转化效率也达到0.2%—7.8%。

目前，国内有关大麦遗传转化的研究非常少，还处在建立高频再生体系和提高遗传转化效率的研究阶段[10-20]。

国内最早获得大麦转基因植株的研究报道出现于2004年，任江萍等[21]以啤酒大麦品种晋引6号幼胚为材料，用基因枪法对1 200个幼胚进行了轰击，获得了7株阳性植株，转化效率为0.58%，在过表达TrxS的转基因植株中，α-淀
3640 中国农业科学53卷
粉酶和β-淀粉酶的活性有显著性提高[22]。

吕维涛等[23]通过农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ转入大麦，获得了可耐0.7%NaCl的植株。

李静雯等[24]利用RNAi抑制B-hordein的合成，降低了大麦品种Golden Promise 籽粒蛋白质的含量。

随着转基因技术的发展, 转基因植物的安全性已经引起了公众的广泛关注，其中筛选标记基因的存在是转基因植物安全性评价的主要隐患。

人们先后提出了几种获得无筛选标记转基因植物的技术，包括共转化法、定位重组体系、多元自动转化载体系统、转座子再定位系统和同源重组体系等，其中共转化法应用最为普遍[25-26]。

特别是农杆菌介导的双T-DNA载体共转化法，不但可以避免将细菌筛选标记转入植物，而且可以从转基因植物中排除nptII、Bar、hpt等筛选标记，在获得安全型转基因植物方面具有独特优势[26]。

农杆菌介导的共转化系统已经在很多植物如烟草[27]、大豆[28]、玉米[29]、高粱[30]、水稻[31]和小麦[26]中成功获得无筛选标记的转基因植株。

【本研究切入点】虽然大麦Golden Promise的遗传转化效率较高，但是其他大麦品种转化效率仍然很低，需要拓展大麦基因型范围和提高转化效率。

转基因大麦安全问题无疑会受到关注，在国内建立大麦无筛选标记转基因系统迫在眉睫。

【拟解决的关键问题】本研究拟以优良大麦品种Vlamingh为受体，通过对培养基成分及培养步骤进行优化，建立其高效遗传转化体系。

进一步利用农杆菌介导的共转化法将双T-DNA 表达载体导入大麦，并通过后代自然分离获得无筛选标记转基因大麦植株。

本研究将拓宽大麦转基因的受体基因型范围，为大麦基因功能解析和转基因育种提供高效的转化体系，为安全型转基因大麦材料创制提供技术保障。

1 材料与方法
1.1 植物材料和表达载体
供试材料为澳大利亚主栽大麦品种Vlamingh，播种于中国农业科学院作物科学研究所人工气候室，生长期间的温度为25℃，光周期为16 h光照、8 h黑暗。

取授粉后12—14 d 的幼胚用于遗传转化。

T0代转基因大麦植株及时移栽，放置于人工气候室中生长和检测。

T1代转基因大麦植株2018年9月种植于中国农业科学院试作物科学研究所温室，用于筛选无筛选标记转基因植株。

植物表达载体pWMB123由叶兴国实验室构建[26]，包含2段独立的T-DNA区域，一段T-DNA区域含有Bar，另一段T-DNA区域含有GUS（图1）。

将表达载体pWMB123转入农杆菌菌株C58C1后用于大麦转化。

Hin d ⅢPstⅠPstⅠ
SacⅠSpeⅠ
SmaⅠScaⅠScaⅠ
Eco RⅠ
Hin d Ⅲ
Bam HⅠ
1
RB Ubi gus Nos LB aadA RB P35S bar LB
PolyA 13475
bar probe 429 bp gus probe 995 bp
图1 双T-DNA表达载体pWMB123结构
Fig. 1 The structure of pWMB123 vector with double T-DNA regions
1.2 培养基
大麦遗传转化所用的基本培养基为MS，在MS 培养基中添加不同有机物质（表1），所有培养基的pH调整为5.8，121℃灭菌15 min。

将大麦幼胚诱导的愈伤组织分为3份，1份转移到过渡培养基（transition medium，TM），另外2份分别转移到分化培养基（differentiation medium，DM）和改良的分化培养基（modified differentiation medium，DMM：DM培养基添加kinetin（KT）1 mg·L-1、6- benzylaminopurine（6-BA）0.5 mg·L-1和1-naphthaleneacetic acid（NAA）0.05 mg·L-1），光照培养2周，诱导绿芽分化。

将完整的大麦幼胚接种到1/2MS培养基上，进行成苗培养，利用该方法探索吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）和萘乙酸（NAA）不同配比对大麦植株生根的影响。

共利用15种不同生长素配比的培养基对大麦植株的生根效果进行比较（表2）。

此外，根据已发表的文献[9,32]，探索添加IBA，且没有其他生长素的第一次筛选培养基（first selection medium，SM1）、DM和大麦再生培养基（barley regeneration medium，BRM，NH4NO3 0.32 g·L-1、KNO3 3.64 g·L-1、KH2PO4
18期 龚强等：农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得 3641
表1 农杆菌介导转化大麦幼胚所用培养基及其组成
Table 1 Composition of the media used for Agrobacterium -mediated barley immature embryo transformation (g·L -1)
组分 Composition
侵染液 IM
共培养培养基
CM
第一次筛选培养基
SM1
第二次筛选培养基
SM2
过渡培养基
TM
分化培养基
DM
MS 0.434 0.434 4.340 4.340 2.700 2.170 麦芽糖 Maltose 30 30 20 20 葡萄糖 Glucose
10
10
乙酰丁香酮Acetosyringone 0.02745 0.03924 谷氨酰胺 Glutamine
0.75 酪蛋白水解物Casein hydrolysate 1 1 肌醇 Myoinositol 0.35 0.35 脯氨酸 Proline 0.69 0.69 盐酸硫胺Thiamine HCl
0.001
0.001
0.004
麦草畏Dicamba 0.0025 0.0025 二氯苯氧乙酸2, 4-D
0.0025
硫酸铜CuSO 4 0.00125 0.00125 0.00125 0.00125 6-苄氨基嘌呤6-BA 0.0001 琼脂糖Agarose 8 植物凝胶Phytagel 3.5 3.5 3.5 3.0 草铵膦Phosphinothricin a
0.005 0.010 0.010 0.005 羧苄青霉素Carbenicillin a
0.25
0.25 0.25 0.25
头孢噻肟Cefotaxime a
0.25 a
需过滤除菌，培养基灭菌完成后再添加。

IM ：侵染液；CM ：共培养培养基；SM1：第一次筛选培养基；SM2：第二次筛选培养基；TM ：过渡培养基；DM ：分化培养基 a
Need to filter sterilization, add the medium after sterilization. IM: Infection medium; CM: Co-culture medium; SM1: First selection medium; SM2: Second selection medium; TM: Transition medium; DM: Differentiation medium
表2 不同激素配比的15种1/2MS 生根培养基
Table 2 Composition of 15 rooting media with different hormone
ratios on the basis of 1/2 MS medium (mg·L -1)
培养基编号 Medium ID
IAA
IBA
NAA
SR1 1 1 1 SR2 1 1 2 SR3 1 2 1 SR4 2 1 1 SR5 1 1 0 SR6 1 0 1 SR7 0 1 1 SR8 1 0 0 SR9 2 0 0 SR10 0 0 1
SR11 0 0 1.5 SR12 0 0 2
SR13 0 1 0
SR14 0 1.5 0 SR15 0 2 0 0.325 g·L -1、CaCl 2·2H 2O 0.441 g·L -1、MgSO 4·7 H 2O 0.246 g·L -1、NaFeEDTA 27.53 mg·L -1、MnSO 4·H 2O 84 μg·L -1、H 3BO 3 31 μg·L -1、ZnSO 4·7 H 2O 72 μg·L -1、Na 2 MoO 4·2H 2O 1.2 μg·L -1、CuSO 4·5 H 2O 0.25 μg·L -1、CoCl 2·6 H 2O 0.24 μg·L -1、
KI 1.7 μg·L -1、Vitamin B5 112 mg·L -1、
6-BAP 0.225 mg·L -1、L-glutamine 146.4 mg·L -1、36 g·L -1 maltose stock, and 196 μL·L -1和CuSO 4·5 H 2O
0.245 mg·L -1）的生根效果。

1.3 农杆菌介导转化大麦幼胚
参考BARTLETT 等[8]方法进行农杆菌介导的大麦转化，并进行较大改动，具体步骤如下： 1.3.1 取样和灭菌 分批次种植大麦受体材料，取开花授粉后14 d 左右的未成熟大麦籽粒，用70%乙醇
表面灭菌 1 min ，然后用15%次氯酸钠震荡灭菌15 min ，最后用无菌水洗4—5次。

在显微镜下用解剖刀
掀开大麦种皮，用尖镊子小心剥取大麦完整胚放置于没有乙酰丁香酮的侵染液（infection medium ，IM ）培养基中。

3642 中国农业科学53卷
1.3.2农杆菌侵染和共培养将携带表达载体pWMB123的C58C1农杆菌28℃过夜培养，取2 mL 菌液5 000 r/min离心，然后加入2 mL IM培养基，侵染大麦幼胚约10 min，然后将胚放入共培养培养基（co-culture medium，CM），23℃黑暗共培养。

1.3.3 愈伤组织的诱导 共培养2 d后，切除胚轴，盾片面向上转移到SM1，进行愈伤的诱导和第一次筛选培养，25℃黑暗培养14 d左右，然后将愈伤组织转移到SM2进行第二次筛选培养，25℃黑暗培养21 d 左右。

1.3.4愈伤组织的分化，转基因苗的生根及移栽 将愈伤组织转移到DM，25℃光照条件下培养2—3周，诱导绿芽分化。

然后及时将绿芽转到1/2MS生根培养基（rooting medium，RT）继续25℃光照培养，根系健壮的再生小植株直接移栽到花盆中。

1.4 T0代转基因植株的鉴定
从移栽成活的抗性再生植株上取少量叶片，利用Bar蛋白抗体试纸条法（取1 cm长的叶片，液氮速冻破碎；加入0.4 mL Extractin buffer，将试纸条标有指示箭头的一端浸入buffer内，静止1 min，观察Bar 蛋白抗体表达结果）检测Bar，利用组织化学染色法结合PCR扩增检测GUS。

1.5 T1代中无筛选标记转基因植株筛选
种植T0代Bar和GUS均为阳性的转基因植株，利用新型植物基因组提取试剂盒CW0531（康为世纪生物科技有限公司）从叶片中提取基因组DNA，然后分别用特异引物Bar-F：5′-ACCATCGTCAACCACT ACATCG-3′，Bar-R：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTC ATG-3′和GUS-F：5′-CAAGGAAATCCGCAACCATA TC-3′，GUS-R：5′-TCAAACGTCCGAATCTTCTCCC -3′对基因组中的Bar和GUS进行PCR检测。

PCR扩增体系为2×Taq Master Mix（诺唯赞生物科技有限公司，南京）7.5 μL、10 pmol·L-1引物各0.5 μL和DNA 模板50—200 ng，补充ddH2O至15 μL。

反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。

取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。

统计T1代转基因植株中Bar和GUS 的分离情况，筛选只含有GUS不含有Bar的无筛选标记转基因植株。

1.6 Southern blot杂交
利用CTAB法从转基因大麦叶片中提取高质量基因组DNA，对30 μg基因组DNA用限制性内切酶Eco RⅠ进行过夜酶切，然后利用1%的琼脂糖凝胶在30 V电压下电泳16 h。

将凝胶置于20%盐酸溶液中变性处理10 min，用ddH2O清洗2—3次。

通过真空泵转膜仪将酶切后的DNA片段转移至带正电的尼龙膜上。

以pWMB123质粒DNA为模板，分别用Bar和GUS特异引物（Bar-F、Bar-R、GUS-F和GUS-R）扩增的片段作为探针，探针标记和杂交过程参考DIG High Prime DNA labelling and Detection Starter Kit II （Roche，美国）说明书进行。

利用Tanon 5200化学发光成像系统显影。

2 结果
2.1 不同培养基对大麦愈伤组织分化植株和生根的
影响
将SM2培养基上的大麦幼胚诱导的愈伤组织分为3份，1份按照BARTLETT等[8]方法转移到TM上，在弱光照条件下（光照条件下用纸遮盖培养皿）培养2周；另外2份分别转移到DM和DMM上。

大麦幼胚愈伤组织经在DM和DMM上正常光照培养2周后，发现DMM上大多数愈伤组织的能产生绿芽点或绿苗（图2-A），而DM上仅有少数愈伤组织产生绿芽点（图2-B），表明DMM比DM更适合大麦愈伤组织分化。

将在TM弱光条件下继代培养的愈伤组织转移到DMM培养2周后发现，虽然有绿芽的产生（图2-C），但分化率明显不及直接分化的愈伤组织。

将分化培养基上产生大麦再生小植株直接转移到生根培养基1/2MS上，发现再生植株产生白化现象（图3-A）。

然后在培养基中添加2.5 mg·L-1的CuSO4，发现可以显著降低白化现象（图3-B）。

因此，后续所有使用的生根培养基都添加了2.5 mg·L-1的CuSO4，但是转基因苗在1/2MS培养基上仍然不生根。

为了解决大麦转基因植株生根困难的问题，首先利用一步成苗培养方法激素不同配比对大麦植株生根的影响。

共利用15种不同生长素配比的培养基对大麦植株的生根效果进行了比较（表2），培养10 d后发现单加IBA的生根效果最好（图4）。

不同浓度的IBA 都可以显著促进大麦的生根，其中1 mg·L-1的生根效果最佳，因此，生根培养基中选择添加到1 mg·L-1的IBA。

虽然一步成苗的大麦植株在添加IBA的1/2MS 培养基上生根效果很好，但转基因大麦植株在该培养基上生根效果并不理想。

因此，又探索了添加IBA的没有其他生长素的SM1、DM和BRM的生根效果。

结果表明，大麦转基因植株在仅添加IBA无其他生长
18期龚强等：农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得
3643 A：愈伤组织不经过TM培养直接在DMM分化情况；B：愈伤组织不经过TM培养直接在DM分化情况；C：愈伤组织经过TM培养后在DMM分
化情况
A: Differentiation on DMM without the culture step on TM; B: Differentiation on DM without the culture step on TM; C: Differentiation on DMM after the
culture step on TM
图2 大麦愈伤组织在不同培养基上的分化情况
Fig. 2 Differentiation performance of barley callus on different shoot induction medium
B
A
A：不添加CuSO4；B：添加CuSO4
A: 1/2MS medium without copper sulfate; B: 1/2MS medium with 2.5
mg·L-1 copper sulfate
图3 CuSO4对转基因大麦小植株白化现象的影响
Fig. 3 The effect of copper sulfate on the albinism of transgenic
barley plants
素的DM和BRM虽然生长状态不错，但是仍然很难
生根，而在添加IBA的无其他生长素的SM1的生根
效果很好。

2.2 大麦转基因T0代阳性植株的获得和检测
利用携带pWMB123表达载体的C58C1农杆菌
共转化了大麦品种Vlamingh的138个幼胚，经过愈
伤组织诱导和2次筛选培养，获得了125个抗性愈伤
组织，愈伤组织诱导率为91%。

抗性愈伤组织经过在
优化过的培养基上分化和生根，共获得14棵候选转
基因植株（BL1—BL14），转化效率为10.14%。

将
幼苗及时移栽至花盆，在温室中生长。

然后对T0代
转基因植株进行试纸条检测，并提取基因组DNA进
行目标基因的PCR检测。

Bar蛋白抗体试纸条检测结
果显示全部转基因植株中均含有Bar（图6-A）；组
织化学染色和PCR扩增结果显示，其中4株转基因
株（BL2—BL5）不含有GUS（图6-B和图6-C），
说明携带GUS和Bar的2个T-DNA的共转化效率为
71.43%。

2.3 T1代中无筛选标记转基因大麦植株的获得
为了获得无筛选标记大麦转基因植株，选取4个
Bar和GUS均为阳性的T0代大麦转基因植株BL1、
BL6、BL7和BL8，形成T1代株系，研究T1代中外源
转入基因的分离情况。

理论上，T1代应该分离出4种
类型：Bar+GUS—、Bar—GUS+、Bar—GUS—和Bar+GUS+。

利用PCR方法共检测了98株T1代转基因植株（图7），
在BL8株系获得了2株无筛选标记（Bar—GUS+）植
株（表3），共检测到3株Bar+GUS—类型植株，没有
检测到Bar—GUS—类型植株，其他植株全部为
Bar+GUS+类型（表3）。

根据PCR检测结果，选取部
分T1代转基因植株，分别利用Bar和GUS作探针进
行Southern blot鉴定（图8），进一步证实BL8-15和
表3 T1代株系中Bar和GUS的分离情况
Table 3 Genotyping detection for the Bar and GUS genes in
the selected T1 lines by PCR
株系 Lines Bar+GUS+ Bar+GUS— Bar—GUS+ Bar—GUS—
BL1 19 1 0 0
BL6 23 0 0 0
BL-7 24 2 0 0
BL-8 27 0 2 0
3644 中 国 农 业 科 学 53卷
SR15
SR14SR13SR12SR11SR10
SR9SR1SR2SR3SR4SR5
SR6SR7SR8
图4 大麦再生植株在不同激素配比培养基上的生根情况
Fig. 4 Rooting status of transgenic barley plantlets on 15 media with different hormone ratios
A
B
C
A ：添加IBA 的DM ；
B ：添加IBA 的BRM ；
C ：只添加IBA （没有添
加其他生长素）的SM1
A: DM with IBA; B: BRM with IBA; C: SM1 with IBA and without other auxins
图5 不同培养基成分对大麦再生植株生根的影响 Fig. 5 Effect of different media containing various auxin ratios
on the rooting of transgenic barley plantlets
BL8-19为无筛选标记的转基因植株。

在BL-8株系中无筛选标记植株的获得效率为6.9%，在全部T 1代植株中无筛选标记植株的获得效率仅有2.04%。

以上结果也证实，Bar 和GUS 可以在大麦转基因后代中稳定遗传和表达。

3 讨论
3.1 大麦遗传转化体系优化
目前，国内外大麦遗传转化的受体品种主要为Golden Promise ，基因型范围非常窄。

本研究利用了再生能力比较强的大麦品种Vlamingh ，拓展了大麦遗传转化的范围。

尤其重要的是，该大麦品种为春性，在温室条件下其生长周期比Golden Promise 短一个月以上， Vlamingh 作为受体材料不但可以缩短转化周期，还可以减少在温室培养材料的水电等消耗。

18期 龚强等：农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得
3645
1234567891011121314WT
750500
1234567891011121314WT P M
bp
A ：Bar 蛋白抗体试纸条检测；
B ：GUS 组织化学染色；
C ：GUS 的PCR 检测。

1—14是大麦T 0代转基因植株；WT ：Vlamingh ；P ：pWMB123质粒；M ：DL5000 marker
A: Detection of Bar protein by Quick Stix strips; B: Detection of GUS gene by histochemical staining; C: Detection of GUS gene by PCR. 1-14: T 0 transgenic barley plants; WT: Vlamingh; P: pWMB123 plasmid; M: DL5000 marker
图6 T 0代转基因大麦植株鉴定
Fig. 6 Identification
of
T 0 transgenic barley plants
A
B
500
250
750
75012
3
4
5
6
7
8
91011121314151617181920212223P
M
bp
bp
1—22：T 1转基因株系BL8；23：Vlamingh ；P ：pWMB123质粒；M ：DL2000 marker ；15和19为筛选到的无筛选标记转基因植株
1-22: BL-8 of T 1 transgenic barley plants; 23: Vlamingh; P: pWMB123 plasmid; M: DL2000 marker; 15 and 19 were marker-free transgenic plants
图7 T 1代转基因大麦株系BL8中Bar （A ）和GUS （B ）的PCR 检测 Fig. 7 PCR detection of Bar (A) and GUS (B) genes in T 1 transgenic barley plants
本研究参考BARTLETT 等[8]描述的大麦遗传转化体系，并根据之前的文献报道和叶兴国实验室在小麦遗传转化方面积累的经验，对大麦遗传转化体系进行了优化。

首先，发现同样的大麦愈伤组织经过在TM 上
培养后分化能力下降（图2），因此认为可以省略TM 这一步骤，这样不但缩短了大麦的遗传转化过程，也节省了时间和成本。

另外，还对分化培养基进行了优化发现DMM 分化效果最好（图2）。

通过调节生根
3646 中 国 农 业 科 学 53卷
A ：Bar 的Southern blot 鉴定；
B ：GUS 的Southern blot 鉴定。

WT ：受体对照；M ：DL15000 marker ；BL8-15和BL8-19为筛选到的无筛选标记转基因植株
A: Southern blot of Bar ; B: Southern blot of GUS . WT: Wild type; M: Marker; BL8-15 and BL8-19were marker-free transgenic plants
图8 T 1代转基因大麦植株的Southern blot 鉴定 Fig. 8 Southern blot detection of T 1 transgenic barley plants
培养基中不同激素比例（图4）和培养基关键成分（图5），筛选到了生根效果较好的SM1。

利用优化后的转化体系植株再生率很高，但是由于改良分化培养基和生根培养基用了一些愈伤组织和再生植株，减少了器官齐全转基因植株的数量，最终的转化效率只有10.14%，该体系实际转化效率应该更高。

3.2 无筛选标记转基因大麦植株获得效率
WANG 等[26]对农杆菌转化双T-DNA 载体的12个小麦T 1株系进行了无筛选标记转基因植株筛选，在3个株系中获得了无筛选标记转基因植株，无筛选标记转基因植株的获得效率分别为40.0%、14.3%和7.5%；而在全部T 1代群体（共12个株系）中无筛选标记转基因植株的获得效率仅为4.3%。

MATTHEWS 等[33]利用农杆菌转化双T-DNA 载体，
也成功获得了3个只含目标基因的无筛选标记转基因大麦植株，无筛选标记转基因植株获得效率0.83%—18.55%。

根据孟德尔遗传定律，如果筛选标记基因和目标基因在T 0代转基因植株中都以单拷贝形式存在，T 1代中无筛选标记植株的获得效率应为18.75%，而本研究中BL8株系T 1代中无筛选标记转基因植株的频率仅为6.9%。

本研究T 1代大麦转基因植株的Southern blot 鉴定结果
显示（图8），Bar 和GUS 在转基因植株中整合的拷贝数较高，尤其Bar 的拷贝数在多数转基因植株中高达10个以上，显著降低了无筛选标记转基因植株的频率。

因此，为了提高无筛选标记转基因植株获得效率，需要降低转基因植株中Bar 整合的拷贝数。

MCCORMAC 等[27]发现双T-DNA 载体中2个T-DNA 区的大小影响外源转入基因整合的拷贝数。

WANG 等[26]研究结果也表明，携带Bar 的T-DNA 区段较小导致其在转基因植株中整合的拷贝数较多。

在本研究中，含Bar 的T-DNA 区段长度仅为1.7 kb 左右，而含GUS 的T-DNA 区段长度为4.4 kb ，Southern 结果也显示GUS 基因在转基因植株中的拷贝数确实低于Bar 。

因此，增加含Bar 的T-DNA 区段长度可以降低Bar 在T 0代转基因植株的拷贝数，从而达到增加T 1代无筛选标记转基因植株的获得效率。

3.3 获得无筛选标记转基因植物的意义
目前，转基因植物的生物安全性越来越引起了公众关注，成为了转基因植物商业化种植的主要限制。

实际上选择标记的存在是转基因作物商业化的主要障碍之一。

早期消除选择标记和不必要的载体骨架将有助于克服生物安全性限制，并有助于环境释放转基因
18期龚强等：农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得 3647
大麦。

因此，开发无标记的转基因大麦对于大麦转基因育种和大麦转基因商业化有重要意义。

在植物遗传转化研究中使用的标记基因主要有2种类型：第一种是细菌选择性标记，如bla、kan和aadA 等；第二种是植物选择标记，如nptII、Bar和hpt。

尽管标记基因应用于遗传转化过程显著提高了植物的转化效率，但是由于大多数选择标记编码抗生素或除草剂的基因，获得转基因植株后这些基因在植物基因组中的存在和表达就变得多余。

基因枪介导的共转化可以去除植物选择标记，但是由于细菌选择标记与载体中的目标基因紧密连接，因此不能去除细菌选择标记。

基因枪转化线性植物表达盒可以成功去除转基因植物中的所有标记基因[34-35]。

因此，无筛选标记转基因植株通常利用基因枪介导或农杆菌介导的共转化方法获得。

但是，无筛选标记转基因植株的获得效率与筛选标记基因整合的拷贝数密切相关，而一般情况下基因枪转化产生的拷贝数显著高于农杆菌转化。

所以，农杆菌介导的共转化法是获得无筛选标记转基因植株的最优方法。

4 结论
本研究发现改良的DMM能显著提高大麦愈伤组织的分化能力；添加1.0 mg·L-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳；利用大麦品种Vlamingh 建立了高效遗传转化体系且转化效率可达10.14%，进一步利用双T-DNA的表达载体在T1代中通过自然分离成功获得了无筛选标记大麦转基因植株。

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