GBS核酸检测PPT课件

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GBS感染是新生儿感染的主要原因 ➢早发型感染 多见于出生后1周内。 母婴垂直传播是其主要传播途径。 主要临床表现为败血症(80%)、肺炎(7%)、脑膜炎(6%); ➢ 若晚发治型疗感不染及时,可引发远期后遗症,如智力发育迟缓、视觉听觉丧 多发生于出生1周后。 主失要等为。水平传播:可能与院内感染或家庭接触有关。 常呈隐匿性发病,其特征表现为脑膜炎;1/3的晚 发型疾病出现脑膜炎,故这些生存下来的新生儿中更 易发生神经系统后遗症。
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PCR原理
变性,退火,延伸
一次循环
二次循环 三次循环
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PCR反应体系
PCR反应体系中的主要试剂有:
缓冲液 dNTP 引物 纯化水
酶 模板
一般酶试剂会有配套缓冲液,通常含有Mg2+
通常包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP 与待扩增DNA链互补的DNA片段
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实时荧光PCR技术:是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光 信号的积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对模板进行分 析的方法。
1. 每扩增一条DNA链,就切断一个探针 2. 每切断一个探针,就产生一个单位荧光信号 3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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GBS引起泌尿生殖道感染时,会引起磷脂酶A2和前列腺 素及细胞因子的释放,刺激子宫收缩导致早产。 ➢GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一
产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染,引起 局部和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%~7.2%, 是产妇死亡的原因之一 。
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GBS对新生儿的影响
以上要求需在同一次实验中同时满足
结果分析
➢ 阴性:样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct≤35.00 ➢ 阳性: 样品的FAM通道 Ct≤38.00, HEX通道Ct≤35.00 备注:若样品的FAM通道 38.00<Ct≤45.00,建议重新检测该样本,
若重检结果仍为38.00<Ct≤45.00或Ct≤38.00,判定为阳性; 若Ct不显示且HEX通道Ct≤35.00,判定为阴性。
GBS核酸检测产品
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荧光PCR检测B族链球菌(GBS)
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B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
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产品特点
➢ Taqman 探针实时PCR技术 ➢ 选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子,
设计特异性引物和探针 ➢ 内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果 ➢ UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性 ➢ 适用仪器:Roche LightCycler 480,ABI 7500,Bioer Line-Gene K
✓ 是指怀孕28 周到产后一周这一分娩前后的重要时期 ✓ 围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内,对母亲、胎儿和
新生儿进行一系列的保健工作,使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育 得到很好的保护。
人群GBS带菌率
国外研究表明 ,不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率 约为6.5%~36.0%,国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%~32.4 %,新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群,如肥胖、 糖耐量异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。
➢《围产期GBS预防指南》指出:
GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗
➢Boyer在1989年研究中指出,产时氨苄青霉素使用超过1小时就 可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中 表明,与无产时应用抗生素相比,抗生素预防超过2小时的有效 率是89%,不足2小时的有效率为71%。
GBS概述
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GBS概述
B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS) 学名无乳链球菌,革兰氏阳性链球菌,正常寄
居于阴道和直肠,属于条件致病菌。
在20世纪70年代,GBS已被证实为围产 期母婴感染的主要致病菌之一,在围产医学中 占有不可忽视的地位。
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什么是围产期……
1h 10min
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DNA提取
1mL标本
13,000 rpm 10 min
沉淀 +1mL生 理盐水
13,000 rpm 5 min
沉淀+
50μL DNA提取

标本,GBS阳性对 照品,空白对照品 均需要提取DNA。
取上清至 1.5mL离 心管中保

13,000 rpm 10 min
99-100 ℃ 加热
需 要 专 门 的 PCR 实 验 室及荧光PCR仪。
操作简单。
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PCR介绍
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什么是PCR……
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是 一种分子生物学技术,用于放大扩增特定的DNA片段;可看作 生物体外的特殊DNA复制。
细菌抗原检 测
乳胶微粒凝集试验、协 同凝集试验、对流免疫 电泳试验及酶联免疫试 验等。
操作比培养法简便,成 本低。
由于B族链球菌血清型 较多,容易造成漏检, 灵敏度相对较低。
采用的是所有B族链球菌
荧 光 PCR 方 法 检测
荧 光 探 针 , PCR 法 扩 增 核酸。
cfb 基 因 保 守 序 列 , 所 有 GBS 都 存 在 ; 灵敏 度 最 高,出结果快(<2h),
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GBS对孕妇的影响
➢GBS感染是胎膜早破的重要发病因素 GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力,接种2小时内
即可吸附于母体组织,继而侵入绒毛膜,通过炎症细胞的 吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭,使胎膜局 部张力减低,从而导致胎膜早破 。 ➢GBS生殖道感染是导致早产的重要因素
10min
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PCR体系配制
40 μL 体系:35 μL PCR反应液 + 5 μL DNA模板
PCR扩增
程序: 50℃ 2min
95℃ 5min
实时监测PCR扩增过程
( 95℃ 15s
60℃ 35s ) 45 cycles
FAM 通道
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HEX通道
结果有效性判定
➢ FAM通道检测结果:分析样本,空白对照品: Ct值不显示;阳性对照品: Ct<30.00; ➢ HEX通道检测结果: 分析内参照基因,Ct≤35.00
标本保存
待测样本在2-8℃保存不应超过24小时;-18℃以下保存不超过4天。
第25页/共33页பைடு நூலகம்
检测流程( < 2 h )
DNA 提取
PCR反应体系配制 PCR扩增及结果分析
标本 GBS阳性对照品 空白对照品
分装GBS PCR反应液
加DNA模板
PCR扩增 结果分析
35 min
5 min
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GBS的传播与感染
感染GBS产妇
30~60% 未传染给新生儿
40%~70% 传染给新生儿
97% 无症状
1%~3%
早发性疾病:败血症,肺炎 或脑膜炎
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5%会导致死亡
国内外GBS筛查现状
➢美国疾病控制中心(CDC) 制定了《围产期GBS预防指南》 该指南已经获得以下认可: 美国妇产科学院 美国儿科学会 美国护士助产士协会 美国家庭医生协会 美国微生物学会 美国流行病学会 美国药理学会
水的纯度要求很高,最好只有水分子,不含 其它成份
一般为Taq酶 待扩增DNA链
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PCR扩增仪
➢ PCR温度循环至关重要,PCR扩增仪各参数必须准确。 ➢ 现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。 国外厂家:Bio-Rad,ABI, Roche …… 国内厂家:杭州朗基 ,杭州博日……
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产品优势一
➢ 灵敏度高:采用PCR方法检测DNA,试剂与国际领先试剂性能相同 ➢ 特异性强:不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应
➢ 稳定性好:样本DNA提取质量高,阳性对照品、空白对照品内参基因 扩增曲线高度吻合,试剂稳定 ➢ 无污染:全封闭PCR体系,避免实验室其它PCR产物污染 ➢ 易操作:操作简便,采用预制PCR反应液,无需额外加入内参照基因、 酶等 ➢ 速度快:检测周期短,从核酸提取到PCR结束实验过程不到2小时
➢ 在我国,2011年,中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和 孕期保健指南(第1版)》中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。
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《 围 产 期 G B S 预 防 指 南 》 指 出
➢ 对所有孕妇于妊娠35~37 周进行GBS筛查,结果阳性者进行预防性治疗 ➢ 以下情况应进行预防性治疗 : 本次妊娠有GBS 菌尿 上次新生儿GBS 感染史 在妊娠37 周之前分娩 破膜时间超过18小时 分娩体温超过38.0度

头孢唑啉,首次剂量 2G,然后每8个小时 1g,直到分娩

红霉素和克 林霉素治疗 是否有效
否 万古霉素每12小时1g(静 脉注射)直至分娩
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克林霉素每8小时900mg (静脉注射)直至分娩
方法学
具体方法
优势
劣势
细菌培养
选血后S24T平择hA续后E皿肉P,药培汤签药养敏培定敏1养板学8学-3液条分实61h培析8;验-。养24:4h-,结成分析果本。判低读,直可观进,行易药开敏展学,周 特 妇 G敏 人B期员别 不 度S长需不 知 较感(要适 道 低染1较合 自;的8-深临 身实情60的况产 是验h)经;否操时,验,有作孕 灵。
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产品优势二
公司GBS、 UU (解脲脲原体)、NG(淋球菌)、CT(沙眼衣原体) 四 个核酸检测试剂盒检测样本类型,DNA提取步骤和PCR扩增程序相 同,结果阈值线的设定也相同;四个病原体可以同时依次进行DNA提取、 PCR扩增步骤,区别只是所用试剂不同。如果客户四个检测项目全部使 用公司产品,会节省时间和工作量,符合客户操作简便的要求。
PCR原理
PCR一般由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂, 形成单链DNA 。 ②退火 :(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形 成局部双链。 ③延伸:(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,以dNTP为原料,从引物 的3′端→5′端延伸,合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍;2~3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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GBS的筛查与预防
孕35-37周取阴道和直肠拭子作GBS检测
阳性(+)
抗生素预防
阴性(-)
未检测
临产后GBS检测
阴性( - ) 且无产时高危因素
阳性(+)
或产时高危因素:早产,产时发热 ≥38 ℃,胎膜早破≥18小时
抗生素预防
不需要抗生素预防
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预防GBS疾病的抗生素使用方案举例:
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PCR反应特点
特异性强:引物与模板DNA特异正确结合 ,碱基配对原则 ,Taq DNA 聚合酶忠实性扩增 灵敏度高 :PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克 (pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平 简便快速:一般在1~4 小时完成扩增反应 模板纯度要求低 :不需要分离病毒/细菌/培养细胞,DNA 粗制品及 RNA均可作为扩增模板
挑战:我妈妈会
进行IAP治疗吗?
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有无青霉素过敏
《围产期GBS预防指南》

青霉素G,首次剂量500万单位 (静脉注射)然后每4小时250〜 300万单位,直至分娩或者氨苄青 霉素,首次剂量2g(静脉注射), 然后每4个小时1g,直到分娩

病人在接受青霉素或 头孢菌素时有无出现 下列任一症状? 过敏症、血管性水肿、 呼吸窘迫、荨麻疹
等多色荧光PCR仪
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试剂盒介绍
➢ 规格:20人份/盒 ➢ 有效期:-18 ℃以下避光保存6个月 ➢ 试剂:DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳性对照品,空白对照品 ➢ 标本类型:生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本
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标本要求
➢ 溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响,应尽量避免 这些样本的检测。 ➢ 其他常见干扰物质(粘液和脓液)以及常用药物(青霉素G、阿奇 霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太 尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露)均无明显影响。
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