一种新的灵长类IL_4基因表达产物纯化方法
核酸纯化
Code No. 27104 D6943-01 U0588A DP103-02 9760
Price/Kit (RMB) 964 224 676 152 350
Price/rxn (RMB) 19.28 2.24 13.52 3.04 7
RNaseA 冻干粉/室温 液态/室温 冻干粉/室温 液态/室温 液态/-20℃
Y Y Y Y N
Recovery 70~80% 50~80% 70~90% 70~85% 70-90%
Price/reac (RMB)
18.88 4.48 9.6 4.32 7
Fragment Size
70bp~10k 50bp~40k 50bp~20k 100bp~10k 50bp~50k
TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (50)
收率
Conclusion：
1.DNA回收率优于或与其它公司相当。
2.与其它公司相比较，价格合理。
DNA片段长度
11
9762市场竞争情况
Product QIAquick Gel Exteaction Kit (50) Gel Extraction Kit(50) NucleoSpin® Gel and PCR clean up TIANgel Mini Purification Kit(50) Company Qiagen Omega MN Tiangen Takara
8
片段回收纯化-9761、9762
片段直接纯化 切胶回收纯化 回收率计算： 9761 9762 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。
常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDaIgG 150 50，25IgM 900 65，25IgM单体180 65，25硫酸铵沉淀法：基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。
适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含%叠氮钠）缓冲液洗脱；5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；6.抗体保存浓度在mg/mL适宜，-20 ℃保存不超过一个月，避免反复冻融。
亲和层析法基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。
成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。
protein A的B结构域protein A的各个结构域protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。
基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。
重组人生长激素生产工艺流程
重组人生长激素生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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白细胞介素4诱导蛋白1(IL4I1)在免疫调节中的作用研究进展
细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Im m U n〇l)2021, 37( 1)79•综述.文章编号：1007-8738(2021 )01"0079>05白细胞介素4诱导蛋白1(IL4I1)在免疫调节中的作用研究进展刘文倩，董成亚，刘向荣*(首都医科大学附属北京天坛医院，国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京100070)[摘要]白细胞介素4诱导蛋白1(11411)是一种分泌型氨基酸氧化酶，由抗原提呈细胞产生，可将苯丙氨酸氧化为苯丙酮酸。
IW I1通过抑制T细胞增殖、分化并限制B细胞增殖，发挥免疫抑制作用；参与机体感染防御；作为肿瘤不良预后相关基因，参 与肿瘤免疫逃逸；在自身免疫性脱髓鞘疾病中，调节小胶质细胞极化表型，促进髓鞘再生，但具体作用机制尚不明确。
我们总 结了 1W I1在机体中的免疫调节作用及机制，以期为感染、肿瘤和自身免疫性疾病的治疗提供新思路。
[关键词]白细胞介素4诱导蛋白1(I L4I1);免疫调节；肿瘤免疫逃逸；自身免疫性疾病；髓鞘再生；综述[中图分类号]R392. 9, R392.l l，R593. 2, G353.ll [文献标志码]AThe role of IL4I1 in immunoregulation ：An updateLIU Wenqian,D O N G Chengya,LIU Xiangrong*National Center of Clinical Medicine for Neurological Diseases, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100070, China* Corresponding author, E-m ail：Ixrpumc@[Abstract]Interleukin^ induced 1protein (IL4I1), a secreted amino acid oxidase produced by antigen presenting cells, oxidizes phenylalanine to phenylpyruvate. It has been found that IL4I1 exerts an immunosuppressive function by inhibiting the proliferation and differentiation of T cells as well as limiting the proliferation of B cells. IL4I1 is involved in host defense against infection. As a gene related to poor prognosis in cancers, IL4I1 participates in tumor immune escape. IL411promotes remyelination via regulation of the different phenotypes of microglia in the autoimmune demyelinating diseases, but the detailed mechanism still remains unknown. W e summarize the role and mechanism of IL4I1 in the immune regulation to provide new ideas for the treatment of infections, cancers and autoimmune diseases.[Key words] interleukin^ induced gene 1(IL4I1) ；immune regulation；tumor immune escape；autoimmune disease；remyelination；review白细胞介素4诱导蛋白1(interleukin~4induced 1 protein,II4I1)是一种L型氨基酸氧化酶，因其可以 在细胞因子白细胞介素4(interleukin4，IL4)诱导下 表达而命名。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
(完整word版)PCR引物流程设计详解
PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL—4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、使用primer premier 5。
0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为：1—200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100—150bp，故设定上游引物位置为201—248,下游引物位置为249—425,产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况(上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理,录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC％8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页,并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL—4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。
干细胞生物学智慧树知到答案章节测试2023年同济大学
第一章测试1.干细胞可以分为多潜能干细胞和组织干细胞两种类型，组织干细胞根据来源又可以分为胚胎组织干细胞和成体组织干细胞。
（）A:对B:错答案:A2.多潜能干细胞可以根据其分化潜能分为Naïve态和Primed态，也就是原始态多能性和激发态多能性。
最初建立的小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞都是处于Primed状态的。
（）A:对B:错答案:B3.胚胎的发育起始于精卵结合后形成的具有全能性的受精卵，全能性胚胎经历6-7次细胞分裂后会形成着床前的囊胚，此时胚胎由滋养层细胞和内细胞团细胞组成，胚胎干细胞就是从具有多潜能性的滋养层细胞建系获得的。
（）A:错B:对答案:A4.体细胞核移植和诱导多能干细胞技术是现在最可靠的将体细胞重编程为全能性胚胎或多能性干细胞的两种方法。
（）A:对B:错答案:A5.全能性是指细胞具有发育为整个个体和支持个体发育的胚外组织的能力，只有受精卵和早期胚胎的卵裂球具备全能性；多能性是指细胞具有发育为整个个体所有细胞类型的能力。
（）A:错B:对答案:B6.最早的体细胞核移植实验是在哺乳动物中完成的。
（）A:错B:对答案:A7.通过显微操作构建的只两个雄原核的孤雄胚胎会在发育至一定阶段死亡，但含有两个雌原核的孤雌胚胎不会。
（）A:错B:对答案:A8.印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达。
（）A:对B:错答案:A9.显微操作仪的构成比较简单，主要由一台倒置显微镜和左右两个显微操作臂组成。
（）A:对B:错答案:A10.体细胞核移植的具体操作由去核和注核两步组成，一般受体是受精卵。
（）A:错B:对答案:A第二章测试1.人的胚胎干细胞形态与小鼠不同，相比而言人胚胎干细胞的克隆形态更加饱满致密。
（）A:错B:对答案:A2.虽然同样来源于植入前囊胚内细胞团，但人类和小鼠胚胎干细胞在形态、培养条件和信号通路上均有很大的差异。
（）A:错B:对答案:B3.胚胎干细胞可分为原态（naïve state）和始发态（primed state）两种类型，原态干细胞的经典代表是灵长类胚胎干细胞，而始发态干细胞的经典代表是啮齿类胚胎干细胞。
卟啉类药物的纯化方法
卟啉类药物的纯化方法
纯化卟啉类药物的方法有很多种，以下提供两种：
方法一：
1. 先进行减压蒸馏，以去除大部分的DMF。
2. 冷却后，将产物倾入大量的冷水中，使铁卟啉结晶析出。
3. 加入浓盐酸进行酸化。
4. 进行抽滤，并用去离子水充分洗涤晶体。
5. 干燥后，使用二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂对晶体进行重结晶。
6. 最后，通过减压升华进行纯化，即可得到铁卟啉。
方法二：使用快速柱色谱法进行分离。
其特点在于使用较大量的细粒硅胶目）来充填玻璃柱，并在分离时在柱子的顶部用氮气加压，使溶剂能保持一定的速度从柱子流出。
不同类型的金属卟啉按它们的极性大小可被分离在不同的馏分中。
以上方法仅供参考，实际操作中应根据实际情况选择合适的方法，并遵循科学、安全的原则。
dna纯化方法
dna纯化方法DNA纯化是生物学和分子生物学领域中的一个关键步骤，它可将杂质从DNA样品中去除，从而获得纯度更高的DNA。
这是必要的，因为当杂质存在于DNA样品中时，它们会干扰后续的实验操作，并影响结果的准确性。
在本文中，将介绍一些常用的DNA纯化方法。
1. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种经典的DNA纯化方法。
它基于DNA与酚和氯仿相容的性质，以及DNA和RNA在高盐浓度下不溶于水的事实。
DNA样品首先需要与酚混合，随后加入氯仿。
这样便可以分离出DNA，因为它呈现为一个清晰的白色层。
提取后的DNA则需要进行洗涤和干燥，最后可以加入纯净的水中重悬。
2. 硅胶柱法硅胶柱法是一种革新性的DNA纯化方法。
使用硅胶柱可以快速、高效地从DNA样品中去除杂质。
在该方法中，DNA样品首先要经过酶解，然后通过硅胶柱。
硅胶柱中的硅胶为DNA提供了一个极高的亲和性，从而可以将杂质去除。
接着，应用适当的酒精沉淀法，可以从硅胶柱中洗出纯净的DNA样本。
3. 盐基法盐基法是一种简单易行的DNA纯化方法。
正如它的名字所暗示的，盐基法主要依靠盐浓度变化来纯化DNA。
在该方法中，DNA样品首先需要与高盐溶液混合。
然后，通过向样品中加入低盐浓度的溶液，可以促使DNA在高盐浓度时还原，从而形成草酸盐。
下一步是通过乙醇沉淀法洗涤并减少盐的浓度，最终得到纯净的DNA。
4. 磁珠法磁珠法是一种快速的DNA纯化方法。
在该方法中，DNA样品首先需要酶解。
接着，加入功能化的磁珠，这些磁珠可以识别和结合到DNA上。
通过加入一些特定的缓冲液和磁场，可将磁珠收集起来，并从样品中去除杂质。
最后，磁珠被去除，且纯净的DNA被洗涤和干燥。
总的来说，科学家可根据实验的需要选择最适合的DNA纯化方法。
这些方法不仅可以去除杂质，而且也可以获得高质量的DNA用于后续的实验。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
第二部分dna产物纯化和凝胶回收
第二部分 DNA产物纯化和凝胶回收分子生物学实验中经常用到基因克隆及载体构建，而PCR和酶切是基因克隆最常用到的技术，在PCR反应中有模板、引物、酶及其他盐类等物质参与，酶切实验中也往往涉及内切酶、其他蛋白及盐类等，这些杂质对后续的实验一般具有较大的影响，因此，必须对目的DNA产物进行纯化。
纯化的方式有直接纯化与切胶纯化，具体运用哪种纯化方法要视具体情况而定。
DNA产物纯化试剂盒：适用于酶切或PCR产物中只有一条DNA片段或所有的片段都需要回收，这种试剂盒属于直接纯化，不需要凝胶电泳，直接对反应产物进行纯化回收。
琼脂糖凝胶回收试剂盒：最常用、适用于绝大多数的DNA纯化实验，可从多条DNA 片段中纯化其中一条或几条。
这种试剂盒属于切胶纯化，需要凝胶电泳，如测序或构建载体，就要对目的条带采取该方法处理。
通用型DNA纯化回收试剂盒：既可以对凝胶溶解纯化，又可以直接对溶液纯化。
本公司生产的DNA纯化回收试剂盒采用可与核酸特异吸附的硅胶膜，通过在低pH和高盐缓冲液中结合DNA，在高pH值和低盐缓冲液或水中洗脱DNA的原理，达到纯化DNA 产物的目的，同时去除各种蛋白质、无机盐和有机物杂质等。
DNA片段回收与纯化技术简介质粒、噬菌体等经酶切、电泳，PCR产物或PCR产物经电泳后，常常需要对其中一些DNA片段进行回收和纯化，以用于克隆、测序或探针标记等实验。
经典DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，由于这些方法操作复杂，回收率偏低等缺点，很少有人再用。
凝胶溶解系统的改进，硅胶吸附膜的利用，使DNA片段回收纯化变得更为容易，目前市场上销售的纯化回收试剂盒大都采用离心柱与硅胶膜结合的模式，以这种方法纯化回收，操作简便，用时短，回收效率高。
DNA片段纯化与回收试剂盒的工作原理在获得DNA片段后，采用吸附材料与之结合，通过漂洗液的清洗去除杂质，用水或洗脱液回收。
目前大多数生物公司都采用硅胶膜作为吸附介质，可以特异地吸附DNA片段，有效去除体系中的蛋白、盐类和有机物质。
2022-2023学年山东省齐鲁名校大联考高三第二次学业质量联合检测生物试卷含答案
2023届山东省高三第二次学业质量联合检测生物学本试卷8页。
总分100分。
考试时间90分钟。
注意事项：1.答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。
2.回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上。
写在本试卷上无效。
3.考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1.某种胰岛素是由51个氨基酸组成的蛋白质，含有2条肽链和3个二硫键。
在提取该胰岛素的过程中，β-巯基乙醇的使用浓度会直接影响其结构。
当β-巯基乙醇的使用浓度过高时，该种胰岛素的二硫键断裂，肽链伸展。
下列叙述错误的是A.胰岛素与糖原均是由多个单体连接成的多聚体B.高浓度β-巯基乙醇改变了胰岛素的空间结构进而导致其功能丧失C.经高浓度β-巯基乙醇处理的胰岛素仍可与双缩脲试剂发生紫色反应D.胰岛素的肽键、二硫键的形成及肽链折叠等过程是在高尔基体内完成的2.液泡是一种酸性细胞器，定位在液泡膜上的ATP水解酶使液泡酸化（H+浓度高）。
液泡酸化消失是导致线粒体功能异常的原因之一，具体机制如图所示（Cys为半胱氨酸）。
下列叙述错误的是A.H+以主动运输的方式从细胞质基质进入液泡B.抑制液泡膜上Cys转运蛋白的活性也会导致线粒体功能异常C.O2在线粒体基质中与[H]结合形成水，同时释放出大量能量D.图示过程说明液泡和线粒体之间既有分工也有合作3.细胞呼吸原理在生产和生活中的应用非常广泛。
下列有关细胞呼吸原理应用的说法，正确的是A.慢跑有利于人体肌细胞利用无氧呼吸产生的ATPB.在零上低温、无氧、干燥的环境中细胞呼吸较弱，有利于果蔬的保存C.选用透气的消毒纱布包扎伤口，有利于人体细胞进行有氧呼吸加快伤口愈合D.中耕松土、稻田排水等措施能够促进植物根细胞进行有氧呼吸，有利于作物生长4.DNA复制过程中，尚未解开螺旋的亲代双链DNA同新合成的两条子代双链DNA的交界处称为复制叉。
白细胞介素简介指南
白细胞介素是由多种产生并作用于多种细胞的一类。
由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。
白细胞介素interleukin 缩写为IL。
关于的表达和调节，有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等许多因子参与。
来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同（例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等），因子自身的物理化学性质多不清楚。
1979年这方面的研究团体提出了在淋巴及因子（monoki－ne）中，已作为一种分子提纯并弄清了性质的称为间[杀菌]素。
最初测定的为IL1和IL2。
IL1属于monokine，以前曾以活化因子（lymphocyte activating factor）命名。
细胞促进蛋白质（mitogenic protein）以及活化因子（B cell－activating factor）等七种名称称之。
而IL2属于淋巴细胞活素，以前曾以刺激因子（thymocyte stimulating factor）、（T cell growth factor）等六种名称称之。
现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。
两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。
白细胞介素在传递信息，激活与调节，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用.2主要分类目前发现了29个白细胞介素（后为35个），分别命名为IL-1---IL29.功能复杂，成网络，复杂重叠。
IL-1(又称淋巴细胞刺激因子)1. 细胞来源主要由活化的单核－巨噬细胞产生。
白细胞介素2. 存在形式IL-1α和IL-1β。
3. 主要生物学功能（1）局部低浓度－－免疫调节：协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌。
（2）大量产生－－内分泌效应：诱导肝脏急性期蛋白合成；引起发热和恶病质。
一种重组人表皮生长因子的新型制备方法[发明专利]
![一种重组人表皮生长因子的新型制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b0dcec1b4a73f242336c1eb91a37f111f1850d84.png)
(10)申请公布号 CN 102757974 A(43)申请公布日 2012.10.31C N 102757974 A*CN102757974A*(21)申请号 201210181522.7(22)申请日 2012.06.05C12N 15/62(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C07K 14/485(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/30(2006.01)C07K 1/18(2006.01)(71)申请人陕西省微生物研究所地址710043 陕西省西安市西影路76号(72)发明人万一 张月娟 张琨 王琰 訾静张志敏王军(54)发明名称一种重组人表皮生长因子的新型制备方法(57)摘要本发明的目的是提供一种方法简单、价格低廉的Ssp 内含肽系统介导重组人表皮生长因子的制备方法，该方法利用液相切割和离子交换层析代替传统的柱上切割和几丁质亲和层析。
采用液相切割代替了传统Ssp 内含肽系统介导的蛋白纯化方法中所用的柱上切割，降低了由于融合蛋白自动裂解造成的目的蛋白的损失；采用离子交换层析替代了昂贵的几丁质亲和层析，大幅度的降低了重组人表皮生长因子的纯化成本，简化了操作步骤，克服了大规模工业化生产重组人表皮生长因子的瓶颈。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 5 页1/1页1.一种重组人表皮生长因子的新型制备方法，其特征在于：按照以下步骤依次进行：1)将hEGF 与内含肽、几丁质结合域融合表达，表达载体为pTWIN1或pTWIN2，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或ER2566；2)将表达融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心获得沉淀，融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，包涵体经洗涤、溶解、复性后，通过液相切割诱导内含肽自切割位点释放hEGF 蛋白，再通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析纯化获得纯度大于97％的不含有多余氨基酸的hEGF 蛋白。
一种纯化胸腺素β4的方法
一种纯化胸腺素β4的方法纯化胸腺素β4（Thymosin β4）的方法有多种，其中包括离子交换色谱、逆相高效液相色谱、凝胶过滤、亲和层析等。
以下将针对其中的几种方法进行详细介绍。
1. 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）：离子交换色谱是一种常用的纯化方法，基于样品中带电荷的分子与固相上具有相反电荷的离子交换基团之间的相互作用。
胸腺素β4是一个富含酸性残基（如谷氨酸和L-赖氨酸）的肽，其中带有负电荷，可以通过阴离子交换基团进行纯化。
具体步骤如下：-将胸腺素β4混合物溶解在合适的缓冲液中，以确保其在所选的制备条件下具有负电荷。
- 将混合物加载到预先平衡的离子交换色谱柱上，使其与离子交换基团相互作用。
离子交换基团通常为阳离子基团，如Q-Sepharose和DEAE-Sepharose。
-通过洗脱缓冲液以逐渐改变离子强度或pH值，来洗脱样品。
洗脱过程中，胸腺素β4将逐渐与柱上的离子交换基团解离，从而被纯化。
-收集洗脱的胸腺素β4溶液，进行进一步的浓缩和纯化。
2. 逆相高效液相色谱（Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC）：逆相高效液相色谱是一种通过分子在非极性固相上的相互作用进行纯化的方法。
胸腺素β4是一个富含疏水残基的肽，可以通过相互作用，如疏水相互作用和范德华力，与逆相固相相互作用。
具体步骤如下：-将胸腺素β4混合物溶解在适当的有机溶剂和水的混合物中，以满足RP-HPLC的条件。
常用的有机溶剂包括乙腈和甲醇。
-将溶解的样品加载到RP-HPLC柱上。
常用的逆相固相柱材料包括C18、C8或C4-使用梯度洗脱溶剂进行洗脱。
典型的梯度洗脱方法从较弱极性溶剂开始，逐渐增加较强极性溶剂的比例，以分离胸腺素β4-收集洗脱的胸腺素β4溶液，并进行进一步的浓缩和纯化。
3. 凝胶过滤（Gel Filtration）：凝胶过滤是一种通过分子在凝胶柱上的大小排除分离的方法。
蛋白纯化方法的选择
蛋白纯化方法的选择蛋白质纯化的方法选择随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。
但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。
相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。
纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。
这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。
在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。
本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。
1蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
单链抗体制备
单链抗体制备单链抗体是一种新型的抗体制备方法，其独特的构成和特异性结合方式使其在疾病诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
以下将围绕单链抗体制备进行详细介绍。
制备单链抗体的关键是通过基因工程技术将由人源或小鼠源免疫细胞产生的重链和轻链基因进行分离，并结合成为单条链的融合蛋白。
这个过程包括以下几个步骤：第一步：基因克隆基因克隆是单链抗体制备过程的第一步，也是最为关键的一步。
从免疫细胞中提取RNA，通过逆转录反应转化为cDNA，然后利用PCR技术扩增重链和轻链基因。
对于轻链基因，由于其存在多样性，可利用特异性引物进行扩增。
对于重链基因，由于其存在固定区和变异区，需利用通用引物与特异性引物结合进行扩增。
扩增出的基因序列需进行测序、比对和分析，以确保其完整和正确性。
第二步：基因融合将重链和轻链基因进行构建，导入表达载体，通过转染、瞬时转染或稳定转化等方式，将其导入目标宿主细胞中，使其表达并产生单链抗体。
最常用的是将重链的C端与轻链的N端通过柔性肽段进行连接，形成一条长链。
此时，需要在适当的位置插入靶向抗原的特异性结合区域，以确保单链抗体对目标抗原的特异性识别。
第三步：纯化表达产物制备出的单链抗体需经过纯化和富集，使其达到高纯度，并去除不必要的蛋白质或杂质，以确保其结构完整性和特异性。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
第四步：表征和活性检测表征和活性检测是单链抗体制备过程的最后一步。
需要对表达产物的特异性、亲和力、抑制力以及交叉反应等进行检测和评价。
包括酶联免疫吸附实验、流式细胞术、免疫组化等。
同时，还需结合细胞毒性、病原学评估、生物稳定性等进行评估，以确保其安全性和有效性。
综上所述，单链抗体制备具有技术难度大、流程复杂、成本高等挑战，但其具有广阔的应用前景和丰富的临床价值，可在癌症、自身免疫疾病、传染病、神经系统疾病等领域中发挥重要的作用。
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重组蛋白的表达与纯化是研究蛋白结构和功能的最基本的前提条件。
在蛋白的功能研究中，目的蛋白的纯度一般要达到80％以上并且在纯化的过程中必须保证蛋白重要结构，例如二硫键等的完整以避免破坏其生物学功能而严重影响后续工作。
因此，目的蛋白的纯化成为许多实验室蛋白研究工作的瓶颈，一些实验因无法得到可靠的有活性的纯蛋白而不得不被迫放弃。
实验室常用的纯化重组蛋白的方法是根据蛋白分子的不同特性，利用色谱法的相关技术进行分离，主要包括四种方法：①根据生物分子的电荷特性进行离子交换的方法；②根据生物分子的大小进行分子筛的方法；③根据生物分子的亲水或疏水特性进行疏水性交互作用的方法；④根据生物分子的配体结合特性进行亲和性结合的方法［1］。
重组蛋白表达、纯化方法的选择是基于后续工作的需要，对于绝大多数蛋白研究工作而言，维持蛋白质关键结构的完整是保持蛋白生物学活性的必须，也是实验过程中必须解决的关键技术难题。
我们利用质粒pET-30a 在大肠埃希菌BL21中克隆并表达了灵长类的IL-4基因，在纯化表达产物时积累了一定的经验并有所创新，较好地解决了这一难题，开拓了思路。
1材料与方法1．1材料及主要试剂重组质粒pET-30a （＋）-IL-4（由中山大学中山医学院病原生物学系保存）带有His 标签并且具有卡那霉素抗性，表达宿主菌为大肠埃希菌BL21；Ni-NTA Agarose 为Qiagen作者简介：袁竹青，女，医学博士，研究方向：分子免疫学。
一种新的灵长类IL-4基因表达产物纯化方法袁竹青1，李剑1，汤云霞2，吴忠道3，余新炳3（1．广州医学院病原生物学教研室，广州510182；2．广州医学院第一附属医院，广州510120；3．中山大学中山医学院寄生虫学教研室，广州510080）【摘要】目的研究一种能保持重组蛋白活性的新的蛋白纯化方法。
方法IPTG 诱导表达重组质粒pET-30a （＋）-IL-4，取可溶性部分进行Ni-NTA agarose 非变性方法纯化，随后逆向利用Biologic Duoflow Chromatography 系统阴离子交换柱进一步分纯，并用Western Blot 鉴定所得纯化蛋白。
结果重组质粒pET-30a （＋）-IL-4有部分可溶性表达，经Ni-NTA agarose 非变性的方法纯化后仍有部分杂蛋白的存在，利用Biologic Duoflow Chromatography 系统阴离子交换柱进一步分纯后得到高度纯化的重组蛋白并经Western Blot 鉴定为目的蛋白。
结论利用创新方法经两个纯化步骤得到了有活性的目的蛋白。
【关键词】IL-4；蛋白纯化；Chromatography 系统中图分类号：392-33文献标识码：AAn Innovative Method for the Purification of Recombinant IL -4from Macaca mulattaYUAN Zhu -qing 1，LI Jian 1，TANG Yun -xia 2，WU Zhong -dao 3，YU Xin -bing 3（1.Guangzhou Medical College ，Guangzhou 510182；2.The First Affiliated Hospital of GuangzhouMedical College,Guangzhou 510120；3.Sun Yat -sen University ，Zhongshan Medical School,Guangzhou 510080,C hina ）【Abstract 】Objective Develop an innovative method to purify biologically active recombinant protein.Methods Recombinant IL -4expression plasmid pET -30a （+）was induced by IPTG and Ni -NTA agarose was used forthe purification of recombinant protein.Biologic Duoflow Chromatography system was used for further purification.Thepurified protein was identified by Western Blot.ResultsSoluble recombinant IL -4was purified using Ni -NTA agaroseand Biologic Duoflow Chromatography.The protein was confirmed by Western Blot.Conclusion Active recombinantIL -4can be purified by these two steps purification method.【Key words 】IL -4；protein purification ；Chromatography·实验研究论著·[文章编号]1672-3619（2010）11-1277-04公司产品；MonoBeads TM阳离子交换柱（1ml）及Resource Tm Q 阴离子交换柱（1ml）均购自Amersham Biosciences公司；IL-4单克隆抗体购自BD公司；30kDa蛋白离心浓缩管和0．45μm PVDF膜为Millipore公司产品；Biologic Duoflow Chromatography系统为Bio-Rad Laboratories产品。
1．2方法1．2．1重组质粒pET-30a（＋）-IL-4的诱导表达将含有重组质粒的大肠埃希菌BL21接种到含卡那霉素LB液体培养基中，摇菌培养至OD600值约0．6，加入终浓度为1m mol/L的IPTG，28℃诱导表达12h。
表达结束后，将样品常规处理，取15μl上清液加样，进行SDS-PAGE电泳。
电泳结束后，考马斯亮蓝染色凝胶1h后脱色观察。
1．2．2重组IL-4蛋白（recombinant IL-4，reIL-4）Ni-NTA agarose非变性的方法纯化以相同方法大量诱导表达阳性重组质粒转化菌，离心集菌并称重。
按3ml／g的比例加入结合缓冲液（50m mol/L NaH2PO4；500m mol/L NaCl；10m mol/L 咪唑；2％吐温20；pH8．0）及蛋白酶K（终浓度为1mg／ml）重悬细菌，冰浴30min。
于冰上超声裂解后。
3600r／min 离心裂解液20min。
取20ml上清与用结合缓冲液平衡过的0．6ml Ni-NTA agarose室温结合2h。
20ml洗涤缓冲液（50m mol/L NaH2PO4；500m mol/L NaCl；40m mol/L咪唑；2％吐温20；pH8．0）清洗agarose，共3次。
随后用8ml洗脱缓冲液（50mmol/L NaH2PO4；500m mol/L NaCl；250m mol/L咪唑；2％吐温20；pH8．0）洗脱出与His－标签结合的蛋白。
蛋白离心浓缩管（30kDa）离心浓缩蛋白溶液，SDS-PAGE电泳分析。
用5mol/L NaOH处理用过的Ni-NTA agarose30min，agarose由白色转变为蓝色后保存于保存液中（结合缓冲液＋0．02％叠氮钠），可重复使用。
1．2．3重组IL-4蛋白Biologic Duoflow Chromatography系统纯化经上述步骤纯化后的样品中仍有杂蛋白的存在，需进一步纯化。
根据我们对IL-4的了解并结合实际，决定选用离子交换法（Biologic Duoflow Chromatography系统）对样品进行进一步纯化。
利用MultiIdent软件推算出IL-4的等电点（isoelectric point，pI）为9．39，因而选用阳离子交换柱进行蛋白分离。
但因为蛋白沉淀以及杂蛋白干扰等技术问题无法解决而放弃。
我们创新性地试用阴离子交换柱，收集未结合蛋白的逆向思维方法进行纯化，获得了较好的结果。
所用溶液为：起始溶液（20m mol/L Na2HPO4＋50m mol/L NaCl，pH8．0）；洗脱溶液（20m mol/L Na2HPO4＋1mol/L NaCl，pH8．0），所有配制的溶液均经0．22μm的真空抽滤去除杂质。
经Ni-NTA agarose纯化后reIL-4蛋白样品首先用起始溶液4℃透析过夜，随后蛋白样品与起始溶液等比例稀释，加样量为1ml，流速为1ml／min。
操作程序如表1所示。
根据同步计算机显示，分别收集代表未结合蛋白峰值处的溶液和洗脱出的3个峰值处的溶液，浓缩处理后进行SDS-PAGE电泳分析。
每纯化完一次样品，分别用ddH2O；1mol/L NaCl溶液；1mol/L NaHO溶液；10％HCl溶液；1mol/L NaCl溶液及ddH2O清洗离子交换柱，每种溶液清洗15min。
当用上述常规方法无法彻底清洗离子交换柱时（系统的压力因柱内残留的蛋白的存在而超过压力警界限时），利用胃蛋白酶溶液（1mg／ml）清洗离子交换柱1h，随后常规清洗。
1．2．4Western Blot分析由于没有针对灵长类的抗体，猴IL-4与人IL-4序列的同源性高达94．8％，因此我们选用鼠抗人IL-4单克隆抗体作为一抗进行实验，以用Ni-NTA agarose 纯化E．coli BL21表达pET-30a（＋）空载体蛋白为阴性对照。
用15μl阴性对照样品、3ng reIL-4蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，利用半干电转移设备，15V20min将蛋白质转移到甲醛预处理的PVDF膜上。
PBS封闭液4℃封闭PVDF 膜过夜。
10ml封闭液加入1μg IL-4单克隆抗体，室温结合2h。
TBS溶液洗膜15min，重复4次。
用二抗血清（HRP标记山羊抗鼠IgG）与PVDF膜室温孵育1h。
TBS溶液洗膜15min，重复4次。
利用HRP化学发光感光试剂盒感光PVDF 膜并冲洗BioMax MR胶片。
2结果2．1SDS-PAGE电泳所示重组质粒诱导表达及Ni-NTA agarose纯化结果重组质粒pET-30a（＋）-IL-4在大肠埃希菌BL21中表达，并有少量可溶性表达。
图1A显示为重组蛋白表达的可溶性部分：含重组质粒pET-30a（＋）-IL-4的细菌经IPTG诱导后，在接近蛋白质低分子量标准（20000Mr）处有一蛋白条带（箭头所示），与推测分子量（17000Mr）相符。