我国主要烟草青枯病病圃青枯菌系统发育分析

我国主要烟草青枯病病圃青枯菌系统发育分析
作者：谭茜李杰汪代斌徐小洪刘颖丁伟
来源：《中国烟草科学》2022年第02期
摘要：为探究我国主要植烟区烟草青枯病鉴定病圃中青枯菌的系统发育，采用演化型分类框架下的序列变种分类方法，对从各烟株和土壤样品中分离得到的100株青枯菌进行系统发育分析。

结果表明，所有菌株可归为4个分支，分别为序列变种15、17、34、54。

其中，云南文山州广南县病圃中的菌株为序列变种17和54，福建泰宁县的菌株为序列变种34，福建三明市三元区的菌株为序列变种15和34，广东白云区的菌株为序列变种15和17，广东南雄市的菌株为序列变种15、17和34，安徽宣城市宣州区的菌株为序列变种34和54，贵州福泉的
菌株为序列变种17，重庆彭水的菌株为序列变种17。

本研究发现同一病圃中存在多个序列变种，某些病圃同一地块中烟株与土壤分离所得菌株序列变种不一致。

关键词：烟草青枯菌;田间抗性鉴定病圃;菌株分离;序列变种;内切葡聚糖酶基因
Phylogenetic Analysis of Ralstonia solanacearum Strains from the Main Disease IdentificationNurseries in China
TAN X LI Jie WANG Daibin XU Xiaohong LIU Ying DING Wei
Abstract：Inorder to explore the phylogenetic relationships of Ralstonia solanacearum strains in the disease identification nurseries of tobacco bacterial wilt in different regions， 100 Ralstonia solanacearum strains isolated from diseased tobacco plants and soil samples were analysedbyusing the phylotype classification schemes. The phylogenetic analysis results showed that all the isolates can be classified into 4 sequevars， including sequevar 15， 17， 34， and 54. Among them， the isolates from Guangnan， Wenshan， Yunnan were sequevar 17 and 54， the isolates from Taining， Fujian were sequevar 34， the isolates from Sanyuan， Sanming， Fujian were sequevar 15 and 34， the isolates from Baiyun， Guangdong were sequevar 15 and 17， the isolates from Nanxiong，Guangdong were sequevar 15， 17 and 34， the isolates from Xuanzhou， Xuancheng， Anhui were sequevar 34 and 54， the isolates from Fuquan， Guizhou were sequevar 17， and the isolates from Pengshui， Chongqing were sequevar 17. It was found that there were multiple sequevars in the same disease nurseries， and the sequevar of isolates from diseasedplantswere not consistant with the isolates from soil in the same disease nurseries.
Keywords：Ralstonia solanacearum; disease nursery for field resistance identification;strain isolation; sequevar;egl
煙草青枯病是由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种严重土传病害，每年给我国烟草生产造成巨大损失[1-2]。

烟草青枯病作为一种典型的高温高湿病害，广泛分布在热带、亚热带以及温带地区。

我国主要在长江流域及其以南地区发生，特别在福建、贵州、重庆及广东等省危害最为严重[3-4]。

青枯菌由于其寄主范围、地理分布、致病性以及生理特性的差异被认为是多变的物种复合体[5]。

选育抗病品种是防治烟草青枯病的重要措施，明确不同地区青枯菌的遗传进化关系，有利于根据不同地区青枯菌的分布选育合适的烟草品种，为防治烟草青枯病提供理论基础。

随着分子生物学技术的不断进步，2005年FEGAN等[6]提出了演化型分类框架，用以描述青枯菌种下的差异，该框架将青枯菌划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）以及克隆（Clone）4个不同水平的分类单元。

其中演化型的划分与青枯菌地理起源紧密相关，而演化型又是由多个序列变种组成，用于界定的基因包括内切葡聚糖酶基因egl，过敏反应与致病性基因hrpB，一个编码纠正蛋白的基因mutS等[6-7]。

烟草品种抗病鉴定病圃作为烟草品种抗性鉴定的重要资源，在选育烟草抗性品种中起着重要作用，病圃年度间发病均匀且常年未使用化学药剂和
其他防治措施，是研究烟草青枯菌自然条件下菌株进化关系的优良材料[8]。

目前我国烟草产区的田间抗青枯病鉴定病圃主要分布在贵州福泉、云南文山、安徽宣城等地[9-12]。

本研究分别对全国6个省份8个烟草青枯病鉴定病圃的烟草病株及土壤样品进行采集，并分离青枯菌菌株，对病株和对应田块土壤中青枯菌株进行序列变种鉴定并分析其遗传进化关系，为烟草青枯病的防控及进一步依据不同区域病原特性针对性的抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1样品采集
6个省8个典型青枯病田间病圃地理信息如表1所示。

病株采集方法：在田间烟草青枯病发病期，挑选发病中心且病级≤5级的发病烟株，剪除烟叶，将病株茎秆截成20 cm左右切口平整的小段，选取包含病健交接处的烟秆小段用报纸包裹后送回室内进行青枯菌分离鉴定。

土壤样品采集：于病圃中选取发病烟株根际土进行采集，挖出所选病烟株根系，去除较大土壤团块，收集粘附在烟株根际土壤约300 g，用自封袋封存。

采样过程需避免不同样品之间的交叉污染，可全程佩戴一次性手套，采集完一个样品后更换手套。

1.2 试验用培养基
B培养基：细菌蛋白胨10 g/L，酵母提取物1.0 g/L，酪蛋白氨基酸1.0 g/L。

其固体培养基（BG液体培养基基础上加入15 g/L琼脂）121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后冷却至55 ℃左右时加入灭菌的1% 氯化三苯基四氮唑（TTC）水溶液和葡萄糖溶液，其終浓度分别为0.005%和0.5%，即为TTC平板。

土壤青枯菌分离培养基：BG固体培养基121 ℃灭菌20 min后，待冷却至50～60 ℃时，加入1% TTC、1%硫酸多粘菌素B、1%杆菌肽、0.1%青霉素、1%氯霉素、1%放线菌酮，使终浓度分别为5、100、25、0.5、5 和100 mg/L，混合均匀后制作平板。

1.3试验方法
1.3.1 病株中青枯菌的分离将烟草病株表面洗净，用经消毒刀片削去植株茎秆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织约1 g置于10 mL灭菌水中，浸泡30 min左右，取浸出液在TTC平板上进行划线分离。

将TTC平板置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

取在TTC培养
基上呈现青枯雷尔氏菌典型菌落形态（中央暗红色，边缘白色）的单菌落4～6个，在新的TTC培养基上进行纯化培养。

1.3.2 土壤中青枯菌的分离称取1 g土样于灭菌的50 mL三角瓶中，加入9 mL无菌水，封口后置于30 ℃恒温摇床上，180 r/min振荡30 min，于超净工作台静置30 min，取上清液1 mL 于灭菌的1.5 mL离心管中，取部分按照与水1：9的比例稀释。

分别取100 μL未稀释和已稀释的上清液涂布于土壤青枯菌分离培养基上，涂好的平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。

1.3.3 青枯菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN， DP302）提取，提取的DNA在−20 ℃保存备用。

1.3.4 序列变种分析用引物Endo-F和Endo-R（Endo-F：ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC，Endo-R：GCGTTGCCCGGCACGAACACC）扩增基因片段，电泳检测后，将PCR产物送华大基因公司测序。

将病圃中分离得到的供试青枯菌菌株测序所得egl基因部分序列（长度666 bp）与GenBank上下载的20个代表性青枯菌的egl序列（表2）进行比对，参考刘颖等[1]方法进行系统发育树构建。

2 结果
2.1病株及土样青枯菌分离情况
自2020年6月至8月，从8个田间病圃中采集病株样品96个，土壤样品86个。

其中，云南文山州广南县病株样和土样各10个，福建泰宁县病株样13个、土样10个，福建三明市三元区病株样和土样各5个，广东白云区病株样5个、土样6个，广东南雄市病株样13个、土样5个，安徽宣城市宣州区病株样和土样各13个，贵州福泉病株样和土样各14个，重庆彭水病株样和土样各23个。

对所有病株及土样进行了青枯菌的分离，共在病株中分离到菌株60株，土样中分离到菌株40株。

各个病圃中菌株分离情况见表3。

2.2 青枯菌株优势序列变种分析
随着分子生物学技术的不断进步，2005年FEGAN等[6]提出了演化型分类框架，用以描述青枯菌种下的差异，该框架将青枯菌划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）以及克隆（Clone）4個不同水平的分类单元。

其中演化型的划分与青枯菌地理起源紧密相关，而演化型又是由多个序列变种组成，用于界定的基因包括内切葡聚糖酶基因egl，过敏反应与致病性基因hrpB，一个编码纠正蛋白的基因mutS等[6-7]。

烟草品种抗病鉴定病圃作为烟草品种抗性鉴定的重要资源，在选育烟草抗性品种中起着重要作用，病圃年度间发病均匀且常年未使用化学药剂和
其他防治措施，是研究烟草青枯菌自然条件下菌株进化关系的优良材料[8]。

目前我国烟草产区的田间抗青枯病鉴定病圃主要分布在贵州福泉、云南文山、安徽宣城等地[9-12]。

本研究分别对全国6个省份8个烟草青枯病鉴定病圃的烟草病株及土壤样品进行采集，并分离青枯菌菌株，对病株和对应田块土壤中青枯菌株进行序列变种鉴定并分析其遗传进化关系，为烟草青枯病的防控及进一步依据不同区域病原特性针对性的抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1样品采集
6个省8个典型青枯病田间病圃地理信息如表1所示。

病株采集方法：在田间烟草青枯病发病期，挑选发病中心且病级≤5级的发病烟株，剪除烟叶，将病株茎秆截成20 cm左右切口平整的小段，选取包含病健交接处的烟秆小段用报纸包裹后送回室内进行青枯菌分离鉴定。

土壤样品采集：于病圃中选取发病烟株根际土进行采集，挖出所选病烟株根系，去除较大土壤团块，收集粘附在烟株根际土壤约300 g，用自封袋封存。

采样过程需避免不同样品之间的交叉污染，可全程佩戴一次性手套，采集完一个样品后更换手套。

1.2 试验用培养基
B培养基：细菌蛋白胨10 g/L，酵母提取物1.0 g/L，酪蛋白氨基酸1.0 g/L。

其固体培养基（BG液体培养基基础上加入15 g/L琼脂）121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后冷却至55 ℃左右时加入灭菌的1% 氯化三苯基四氮唑（TTC）水溶液和葡萄糖溶液，其终浓度分别为0.005%和0.5%，即为TTC平板。

土壤青枯菌分离培养基：BG固体培养基121 ℃灭菌20 min后，待冷却至50～60 ℃时，加入1% TTC、1%硫酸多粘菌素B、1%杆菌肽、0.1%青霉素、1%氯霉素、1%放线菌酮，使终浓度分别为5、100、25、0.5、5 和100 mg/L，混合均匀后制作平板。

1.3试验方法
1.3.1 病株中青枯菌的分离将烟草病株表面洗净，用经消毒刀片削去植株茎秆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织约1 g置于10 mL灭菌水中，浸泡30 min左右，取浸出液在TTC平板上进行划线分离。

将TTC平板置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

取在TTC培养基上呈现青枯雷尔氏菌典型菌落形态（中央暗红色，边缘白色）的单菌落4～6个，在新的TTC培养基上进行纯化培养。

1.3.2 土壤中青枯菌的分离称取1 g土样于灭菌的50 mL三角瓶中，加入9 mL无菌水，封口后置于30 ℃恒温摇床上，180 r/min振荡30 min，于超净工作台静置30 min，取上清液1 mL 于灭菌的1.5 mL离心管中，取部分按照与水1：9的比例稀释。

分别取100 μL未稀释和已稀释的上清液涂布于土壤青枯菌分离培养基上，涂好的平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。

1.3.3 青枯菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN， DP302）提取，提取的DNA在−20 ℃保存备用。

1.3.4 序列变种分析用引物Endo-F和Endo-R（Endo-F：ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC，Endo-R：GCGTTGCCCGGCACGAACACC）扩增基因片段，电泳检测后，将PCR产物送华大基因公司测序。

将病圃中分离得到的供试青枯菌菌株测序所得egl基因部分序列（长度666 bp）与GenBank上下载的20个代表性青枯菌的egl序列（表2）进行比对，参考刘颖等[1]方法进行系统发育树构建。

2 结果
2.1病株及土样青枯菌分离情况
自2020年6月至8月，从8个田间病圃中采集病株样品96个，土壤样品86个。

其中，云南文山州广南县病株样和土样各10个，福建泰宁县病株样13个、土样10个，福建三明市三元区病株样和土样各5个，广东白云区病株样5个、土样6个，广东南雄市病株样13个、土样5个，安徽宣城市宣州区病株样和土样各13个，贵州福泉病株样和土样各14个，重庆彭水病株样和土样各23个。

对所有病株及土样进行了青枯菌的分离，共在病株中分离到菌株60株，土样中分离到菌株40株。

各个病圃中菌株分离情况见表3。

2.2 青枯菌株优势序列变种分析
随着分子生物学技术的不断进步，2005年FEGAN等[6]提出了演化型分类框架，用以描述青枯菌种下的差异，该框架将青枯菌划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）以及克隆（Clone）4个不同水平的分类单元。

其中演化型的划分与青枯菌地理起源紧密相关，而演化型又是由多个序列变种组成，用于界定的基因包括内切葡聚糖酶基因egl，过敏反应与致病性基因hrpB，一个编码纠正蛋白的基因mutS等[6-7]。

烟草品种抗病鉴定病圃作为烟草品种抗性鉴定的重要资源，在选育烟草抗性品种中起着重要作用，病圃年度间发病均匀且常年未使用化学药剂和
其他防治措施，是研究煙草青枯菌自然条件下菌株进化关系的优良材料[8]。

目前我国烟草产区的田间抗青枯病鉴定病圃主要分布在贵州福泉、云南文山、安徽宣城等地[9-12]。

本研究分
别对全国6个省份8个烟草青枯病鉴定病圃的烟草病株及土壤样品进行采集，并分离青枯菌菌株，对病株和对应田块土壤中青枯菌株进行序列变种鉴定并分析其遗传进化关系，为烟草青枯病的防控及进一步依据不同区域病原特性针对性的抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1样品采集
6个省8个典型青枯病田间病圃地理信息如表1所示。

病株采集方法：在田间烟草青枯病发病期，挑选发病中心且病级≤5级的发病烟株，剪除烟叶，将病株茎秆截成20 cm左右切口平整的小段，选取包含病健交接处的烟秆小段用报纸包裹后送回室内进行青枯菌分离鉴定。

土壤样品采集：于病圃中选取发病烟株根际土进行采集，挖出所选病烟株根系，去除较大土壤团块，收集粘附在烟株根际土壤约300 g，用自封袋封存。

采样过程需避免不同样品之间的交叉污染，可全程佩戴一次性手套，采集完一个样品后更换手套。

1.2 试验用培养基
B培养基：细菌蛋白胨10 g/L，酵母提取物1.0 g/L，酪蛋白氨基酸1.0 g/L。

其固体培养基（BG液体培养基基础上加入15 g/L琼脂）121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后冷却至55 ℃左右时加入灭菌的1% 氯化三苯基四氮唑（TTC）水溶液和葡萄糖溶液，其终浓度分别为0.005%和0.5%，即为TTC平板。

土壤青枯菌分离培养基：BG固体培养基121 ℃灭菌20 min后，待冷却至50～60 ℃时，加入1% TTC、1%硫酸多粘菌素B、1%杆菌肽、0.1%青霉素、1%氯霉素、1%放线菌酮，使终浓度分别为5、100、25、0.5、5 和100 mg/L，混合均匀后制作平板。

1.3试验方法
1.3.1 病株中青枯菌的分离将烟草病株表面洗净，用经消毒刀片削去植株茎秆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织约1 g置于10 mL灭菌水中，浸泡30 min左右，取浸出液在TTC平板上进行划线分离。

将TTC平板置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

取在TTC培养基上呈现青枯雷尔氏菌典型菌落形态（中央暗红色，边缘白色）的单菌落4～6个，在新的TTC培养基上进行纯化培养。

1.3.2 土壤中青枯菌的分离称取1 g土样于灭菌的50 mL三角瓶中，加入9 mL无菌水，封口后置于30 ℃恒温摇床上，180 r/min振荡30 min，于超净工作台静置30 min，取上清液1 mL 于灭菌的1.5 mL离心管中，取部分按照与水1：9的比例稀释。

分别取100 μL未稀释和已稀释
的上清液涂布于土壤青枯菌分离培养基上，涂好的平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。

1.3.3 青枯菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN， DP302）提取，提取的DNA在−20 ℃保存备用。

1.3.4 序列变种分析用引物Endo-F和Endo-R（Endo-F：ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC，Endo-R：GCGTTGCCCGGCACGAACACC）扩增基因片段，电泳检测后，将PCR产物送华大基因公司测序。

将病圃中分离得到的供试青枯菌菌株测序所得egl基因部分序列（长度666 bp）与GenBank上下载的20个代表性青枯菌的egl序列（表2）进行比对，参考刘颖等[1]方法进行系统发育树构建。

2 结果
2.1病株及土样青枯菌分离情况
自2020年6月至8月，从8个田间病圃中采集病株样品96个，土壤样品86个。

其中，云南文山州广南县病株样和土样各10个，福建泰宁县病株样13个、土样10个，福建三明市三元区病株样和土样各5个，广东白云区病株样5个、土样6个，广东南雄市病株样13个、土样5个，安徽宣城市宣州区病株样和土样各13个，贵州福泉病株样和土样各14个，重庆彭水病株样和土样各23个。

对所有病株及土样进行了青枯菌的分离，共在病株中分离到菌株60株，土样中分离到菌株40株。

各个病圃中菌株分离情况见表3。

2.2 青枯菌株优势序列变种分析
随着分子生物学技术的不断进步，2005年FEGAN等[6]提出了演化型分类框架，用以描述青枯菌种下的差异，该框架将青枯菌划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）以及克隆（Clone）4个不同水平的分类单元。

其中演化型的划分与青枯菌地理起源紧密相关，而演化型又是由多个序列变种组成，用于界定的基因包括内切葡聚糖酶基因egl，过敏反应与致病性基因hrpB，一个编码纠正蛋白的基因mutS等[6-7]。

烟草品种抗病鉴定病圃作为烟草品种抗性鉴定的重要资源，在选育烟草抗性品种中起着重要作用，病圃年度间发病均匀且常年未使用化学药剂和
其他防治措施，是研究烟草青枯菌自然条件下菌株进化关系的优良材料[8]。

目前我国烟草产区的田间抗青枯病鉴定病圃主要分布在贵州福泉、云南文山、安徽宣城等地[9-12]。

本研究分别对全国6个省份8个烟草青枯病鉴定病圃的烟草病株及土壤样品进行采集，并分离青枯菌菌株，对病株和对应田块土壤中青枯菌株进行序列变种鉴定并分析其遗传进化关系，为烟草青枯病的防控及进一步依据不同区域病原特性针对性的抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1样品采集
6个省8个典型青枯病田间病圃地理信息如表1所示。

病株采集方法：在田间烟草青枯病发病期，挑选发病中心且病级≤5级的发病烟株，剪除烟叶，将病株茎秆截成20 cm左右切口平整的小段，选取包含病健交接处的烟秆小段用报纸包裹后送回室内进行青枯菌分离鉴定。

土壤样品采集：于病圃中选取发病烟株根际土进行采集，挖出所选病烟株根系，去除较大土壤团块，收集粘附在烟株根际土壤约300 g，用自封袋封存。

采样过程需避免不同样品之间的交叉污染，可全程佩戴一次性手套，采集完一个样品后更换手套。

1.2 试验用培养基
B培养基：细菌蛋白胨10 g/L，酵母提取物1.0 g/L，酪蛋白氨基酸1.0 g/L。

其固体培养基（BG液体培养基基础上加入15 g/L琼脂）121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后冷却至55 ℃左右时加入灭菌的1% 氯化三苯基四氮唑（TTC）水溶液和葡萄糖溶液，其终浓度分别为0.005%和0.5%，即为TTC平板。

土壤青枯菌分离培养基：BG固体培养基121 ℃灭菌20 min后，待冷却至50～60 ℃时，加入1% TTC、1%硫酸多粘菌素B、1%杆菌肽、0.1%青霉素、1%氯霉素、1%放线菌酮，使终浓度分别为5、100、25、0.5、5 和100 mg/L，混合均匀后制作平板。

1.3试验方法
1.3.1 病株中青枯菌的分离将烟草病株表面洗净，用经消毒刀片削去植株茎秆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织约1 g置于10 mL灭菌水中，浸泡30 min左右，取浸出液在TTC平板上进行划线分离。

将TTC平板置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

取在TTC培养基上呈现青枯雷尔氏菌典型菌落形态（中央暗红色，边缘白色）的单菌落4～6个，在新的TTC培养基上进行纯化培养。

1.3.2 土壤中青枯菌的分离称取1 g土样于灭菌的50 mL三角瓶中，加入9 mL无菌水，封口后置于30 ℃恒温摇床上，180 r/min振荡30 min，于超净工作台静置30 min，取上清液1 mL 于灭菌的1.5 mL离心管中，取部分按照与水1：9的比例稀释。

分别取100 μL未稀释和已稀释的上清液涂布于土壤青枯菌分离培养基上，涂好的平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。

1.3.3 青枯菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN， DP302）提取，提取的DNA在−20 ℃保存备用。

1.3.4 序列变种分析用引物Endo-F和Endo-R（Endo-F：ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC，Endo-R：GCGTTGCCCGGCACGAACACC）扩增基因片段，电泳检测后，将PCR产物送华大基因公司测序。

将病圃中分离得到的供试青枯菌菌株测序所得egl基因部分序列（长度666 bp）与GenBank上下载的20个代表性青枯菌的egl序列（表2）进行比对，参考刘颖等[1]方法进行系统发育树构建。

2 结果
2.1病株及土样青枯菌分离情况
自2020年6月至8月，从8个田间病圃中采集病株样品96个，土壤样品86个。

其中，云南文山州广南县病株样和土样各10個，福建泰宁县病株样13个、土样10个，福建三明市三元区病株样和土样各5个，广东白云区病株样5个、土样6个，广东南雄市病株样13个、土样5个，安徽宣城市宣州区病株样和土样各13个，贵州福泉病株样和土样各14个，重庆彭水病株样和土样各23个。

对所有病株及土样进行了青枯菌的分离，共在病株中分离到菌株60株，土样中分离到菌株40株。

各个病圃中菌株分离情况见表3。

2.2 青枯菌株优势序列变种分析。