固相萃取——高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮药物残留

固相萃取——
—高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮药物残留
万译文1伍远安1*洪波2邓克国2
(1,农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),长沙,410153;
2,湖南省水产科学研究所,长沙,410153)
甲基睾酮(17a-Mehthyltestosterone,C20H30O2)是
一种人工合成的固醇类药物,又叫做甲基睾丸酮、
甲基睾丸素和甲睾酮。

它是一种白色结晶状粉末,
无臭无味,易溶于乙醇、丙酮或氯仿等有机溶剂,
不溶于水,结构式见下图1。

在水产养殖中,它作
为一种性激素既能促进器官成熟与第二特征的发
育,又有促进蛋白质合成的同化作用,使肌肉增长,体重增加,被作为水产品养殖过程中的一种性激素和强壮剂添加到饲料中。

由于甲基睾酮代谢时间长,通过食物链被人体摄入,扰乱人体激素平衡,导致孕妇有女胎男性化和新生儿畸形,影响儿童的正常生长发育,且具有致癌、致畸、致突变的作用。

欧盟95/22/EC中规定在养殖中禁止使用甲基睾酮等性激素类兽药,我国也在2003年发布的公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定甲基睾酮为禁止使用兽药,在动物源性组织中不得检出。

目前对甲基睾酮残留检测的相关研究较少,水产品中激素类药物残留的相关检测标准尚不完善,我国农业部于2006年制定了甲基睾酮残留量的高效液相色谱法检测标准,但是该方法前处理复杂,有机溶剂使用较多,水产品基质复杂采用液液萃取的净化效果不好。

因此本文通过简化前处理过程,采用固相萃取方式进行净化,利用紫外检测器对甲基睾酮进行了检测,缩短了前处理时间,灵敏度高,能实现了对甲基睾酮的快速检测,满足水产品质检以及相关基础研究的要求。

图1甲基睾酮化学结构式
1实验部分
1.1仪器与试剂
Waters2695高效液相色谱仪,配备紫外检测器;旋转蒸发仪(瑞士布奇公司);氮吹仪(美国Organomation公司);固相萃取装置(美国Agilent 公司);超声波清洗器(昆山超声波仪器厂);精密电子天平(梅特勒-托利多称重设备系统有限公司);微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

甲基睾酮标准品(德国R-Biopharm公司);甲醇(色谱纯,德国Merck公司);乙醚、石油醚(色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司);磷酸(优级纯,国药集团化学试剂有限公司);无水硫酸钠(分析纯,于650℃下灼烧4h后储存于干燥器中备用);中性氧化铝柱(3cc/60mg,美国色谱科)。

1.2样品前处理
称取5g(精确至0.01g)样品至于50mL离心管中,加入5g无水硫酸钠,玻棒搅匀,向离心管中加入15mL乙醚提取,漩涡混匀后超声提取5 min,放入冷冻离心机5℃,8000r/min离心10min,
上清液倒入旋转蒸发瓶中,重复操作一次,合并提
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取液。

将提取液于40℃水浴中减压旋转蒸发至干,加入4mL甲醇溶解残渣,充分震荡溶解,将溶液转移至10mL离心管中。

加入4mL正己烷混匀
5000r/min离心5min,弃去上层正己烷层,重复操作一次。

取中性氧化铝柱(3mL/60mg)先用5mL甲醇活化,将备用液过柱,再用2mL甲醇洗脱,收集提取液和洗脱液,40℃氮气下吹干,用1.0mL流动相定容过0.45μm滤膜,滤液供液相色谱测定。

1.3色谱条件
色谱柱为Inertsil ODS-C18柱(250mm×4.6 mm,5μm);流动相A甲醇,B为水(添加0.2%磷酸);流速为1.0mL/min;进样量为20μL;检测波长为254nm。

2结果与讨论
2.1流动相的选择
在高效液相色谱方法中,选择合适的流动相能使目标物能较好的分离,同时不会干扰检测器的正常工作再测定波长范围内没有吸收以及对色谱柱起到保护作用,保证合适的柱压降。

本文比较了甲醇-水、甲醇-水(0.2%磷酸)两种不同的流动相,当采用甲醇-水作为流动相时,经对比发现在流动相中加入一定量的酸使甲基睾酮的目标物峰形更加尖锐,检测灵敏度也得到提高,但是酸性过高的,会影响色谱柱的寿命,本文选择在水中加入0.2%磷酸控制溶液pH值,得到较好的分离效果,见图2。

图2甲基睾酮标准色谱图
2.2提取溶剂的选择
动物源性组织中一般采用乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚等溶剂进行提取,由于甲基睾酮的结构式(图1)可知,两端的羰基和羟基属于极性基团,中间的碳环为非极性基团,故能溶于极性和非极性溶剂,但不能溶于极性很强的水中。

本文比较了乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚三种提取剂。

实验结果表明:这三者作为提取剂时,回收率均在65.9~ 83.6%之间,均满足要求。

但是由于二氯甲烷对人体和环境的毒性较大;乙酸乙酯提取杂质较大,容易出现基质干扰。

本文选择乙醚作为提取剂。

2.3除脂溶剂的选择
由于水产品基质复杂,含有脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质,在前处理过程中一般要进行除脂。

一般常用的除脂剂有正己烷、二氯甲烷和石油醚。

本文比较了这三种不同的除脂剂,由于二氯甲烷的极性和乙醚相差不大,根据相似者相溶的原理,会导致部分目标物被溶于二氯甲烷中,因此不能选择二氯甲烷作为本实验除脂剂。

选用正己烷和石油醚作为除脂剂时,所得溶液均清亮透明,去脂效果好,石油醚有30~60℃和60~90℃两种规格,选用30~60℃的石油醚沸点低溶于挥发,对操作环境要求较高,应选择60~90℃规格石油醚。

经综合考虑,本文选择正己烷作为除脂溶剂。

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2.4净化方式的选择
在前处理过程中常用的净化方式有液液萃取、固相萃取和固相微萃取等方式,在农业部颁布的行业标准SC/T3029-2006中,采用的净化方式是用大量的石油醚进行液液萃取,由于液液萃取操作步骤繁琐、成本高、需要消耗大量的有机溶剂,对操作人员和环境带来毒害,本文比较了3种不同的固相萃取柱(C 18500mg/3mL ,HLB 60mg/3mL ,Alumina-N 60mg/3mL ,PCX 60MG/3mL)对甲基睾酮的净化效果,其回收率的结果见图3,本实验选择利用中性氧化铝柱(3mL/60mg ),步骤简单,净化效果好。

图3不同固相萃取柱的甲基睾酮回收率
2.5
线性范围和灵敏度
用流动相将甲基睾酮储备液稀释成0.05、0.1、0.5、1.0、5.0mg/L 的系列标准工作溶液,以待测物的浓度X(mg/L)为横坐标,待测物的峰面积Y 为
纵坐标制作标准曲线
,可得标准曲线回归方程为Y =图4空白样品色谱图
图5加标样品色谱图(20.0μg/kg )
87.6X+163,相关性系数大于0.9995,见图6。

由此可知甲基睾酮在0.05~5.0mg/L 范围内其标准曲线的线性关系良好,可满足定量分析的要求。

在方法规定的取样质量条件下,在阴性样品中添加甲基睾酮标准溶液(添加水平为10.0μg/kg )经测定信噪比(S/N )均大于3,表明目标物的检
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测下限(LOD )为10.0μg/kg ,在阴性样品中添加甲基睾酮标准溶液(添加水平为20.0μg/kg )经测定信噪比(S/N )均大于10(见图5),表明其定量下限(LOQ )可为20.0μg/kg 。

空白谱图见图4。

2.6回收率和精密度
向草鱼、中华鳖和对虾阴性样品中分别添加
10、50、100ng/g 三个水平的标准品,每个添加水平测定3次,每次平行测定5次,按1.3节所述条件进行加标回收率实验,所得结果为回收率为68.7%~90.7%,相对标准偏差为2.09%
~5.87%,说明能取得良好的回收效果,结果见表1。

图6甲基睾酮标准曲线
表1
甲基睾酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差目标物Drug 添加水平(ng/g )平均回收率/%
相对标准偏差
RSD/%草鱼对虾中华鳖甲基睾酮
1050100
72.182.190.7
74.576.583.6
68.783.288.9
5.873.612.09
2.7实际样品的测定
运用本文建立的方法对市场中采集来的水产品进行了分析检测。

结果表明:该方便简单、快速,具有很好的适用性和可操作性,谱图无干扰,样品中未检出甲基睾酮药物。

3小结
本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮含量的检测方法。

通过对前处理条件以及色谱条件的优化,甲基睾酮在0.05~
5.0mg/L 范围内其标准曲线的线性关系良好,检出下限LOD 为10.0μg/kg ,定量限LOQ 为20.0μg/kg ;在不同的添加水平下,甲基睾酮各组分的平均回收率在为68.7%~90.7%,相对标准偏差为2.09%~5.87%,符合国内外有关标准和法规的要求。

该方法并可为甲基睾酮在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段,对食品的安全工作提供了有力的保障。

参考文献(略)
本刊在2013年第四期(总第135期)第41页刊登的“湖南省2013年饲料添加剂、预混料产品批准文号名单(一)”一文中作如下更正:“有效期”更正为“执行标准”,“执行标准”更正为“核发时间”,“Q/JBBP001-2012”更正为“2013.1.8”。

特此启示。

更正启示
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