噬菌体筛选

噬菌斑分析
1、将合适的宿主菌接种到M9TB培养基上，37℃摇至0D600=1.0；
2、使用前，可将宿主菌保存在4℃，保存超过48h的菌不可使用；
3、熔化足够量的顶层培养基，每个平板需5ml，将熔化后的培养基放在45-55℃的
水浴锅中；
4、使用无菌LB培养基制备一系列稀释度的样品。

通常选择103-106的重组噬菌体
稀释度。

空白对照则选择107；
10-210-310-7
10μL样品
100μL …………
990μL 900μL
5、准备4mL的无菌管，加入250μL的宿主菌。

从最高稀释度开始加起，每管加
入100μL噬菌体稀释液。

注意换枪头；
6、在每管中加入3mL的顶层培养基，混合后倒在无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+平
板上，轻摇使其迅速铺平；
7、平板静置几分钟后，翻转，37℃培养3-4h或室温过夜；
8、数噬菌斑数并计算噬菌体滴度。

如：稀释度为10-6的平板上有200个噬菌斑，则滴度为
200×106×10=2×109pfu/mL
样品中噬菌体总数由滴度×样品总量决定。

如：1μg的载体DNA被包装，最终的包装反应体积为0.3mL（25μL包装提取物+5μL连接物+270μL无菌培养基）。

在包装反应中pfu总数为2×109pfu/mL×0，3mL=6×108pfu。

另外，因为使用了1μg的载体，效率是6×108pfu。

文库扩增
当原始重组体总数少于5×106，选择平板裂解法；当需要大量扩增时，选择液体裂解法。

平板裂解扩增
1、接种1mL过夜培养的宿主菌到50mL TB培养基，37℃摇至OD600=0.6-1.0，如果
使用5615菌，当OD600=0.5时，添加IPTG至终浓度1mM，然后继续摇30min；
2、如果包装反应保存在氯仿里，轻微离心分离出氯仿，将噬菌体吸出；
3、计算需要的细胞和噬菌体量。

每10mL细胞含1×106，将噬菌体和细胞混合，
加入50mL培养基，这些混合物需在20min内倒入平板。

4、转接1mL的噬菌体/细胞混合物到无菌的15mL管子内；
5、每个管子内加入10mL熔化的45-55℃的顶层培养基。

混匀后直接倒到150mm
的无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+平板上，轻轻平摇使琼脂糖培养基铺平；
6、平板静置几分钟，待顶层培养基凝固，翻转，培养至噬菌斑几乎融合（37℃培
养3-4h或室温过夜）；
7、每个平板上加入10mL噬菌体提取Buffer（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl,
6 mM MgSO
4
），置于4℃水平面2h-过夜；
8、平板稍微倾斜，吸取上层液体至无菌管内。

将所有提取Buffer集中
到一个管子内。

加入0.5mL氯仿，轻轻混匀。

3000×g，5min，澄清裂解物，将上清吸到无菌管子内。

经噬菌斑分析决定扩增文库的滴度。

扩增文库的裂解物可在4℃保存滴度不降低。

若要长期保存，加入0.1倍体积的80%无菌甘油，-704℃保存。

液体裂解法
1、从划线的平板上挑取单菌落接种到50mL相应抗性LB培养基中，37℃
摇过夜。

宿主菌可在4℃保存两天；
2、将5mL过夜培养物加入500mL无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+培养基中，
37℃摇至OD
600
=0.6-1.0，如果使用5615菌，当OD
600
=0.5时，添加IPTG 至终浓度1mM，然后继续摇30min；培养物种细胞数计算公式：
cells
OD
mL
OD11
600
8
600
10
5.1
volume
culture
5.0
/
cell
10
2
⨯
=
⨯
⨯
⨯
3、在MOI为0.001-0.01时，用噬菌体感染培养物（每个pfu1，00-1000
个细胞）。

比如，500mL宿主菌培养物OD
600
=0.75，则细胞总数为：
cells
mL
OD
mL
OD11
600
8
600
10
5.1
500
5.0
/
cell
10
2
⨯
=
⨯
⨯
⨯
这一培养物可被1.5 × 108到1.5 × 109pfu感染。

4、37℃摇1-3h至可观察到裂解。

裂解会使OD值下降，培养集中细长残片
会增加。

一旦观察到裂解就停止培养，过分培养会导致滴度降低； 5、8000g ，10min 澄清裂解物。

将上清吸到无菌管子内。

经噬菌斑分析决定扩增文库的滴度。

6、扩增文库的裂解物可在4℃保存滴度不降低。

若要长期保存，加入0.1倍体积的80%无菌甘油，-70℃保存。

文库筛选
目标蛋白包被ELISA 板
1、 用去离子水洗板子数次，轻拍去除水分；
2、 稀释目标蛋白至1-10μg/mL ；
3、 每孔加100μL 稀释蛋白，室温3-4h 或4℃过夜；
4、 每孔用300μL 1×TBS 或水洗3次，洗去未结合的蛋白；
5、 准备5%的阻断剂（用水稀释），每孔加200μL;
6、 室温孵育60min 或4℃过夜；
7、 去离子水洗板子5次，每孔加200μL 水。

盖住板子保存在4℃，待用。

板子可保存数周。

筛选
1、 接种相应的宿主菌至抗性LB 培养基中，37℃摇至0D 600=0.5-0.6；
2、 根据扩增文库的滴度和期望筛到噬菌体数，计算第一轮筛选所需的噬菌体裂解物的量。

比如，一个多肽文库包含1×109原始重组体，期望筛库100次，扩增文库的滴度为3×1011pfu/mL ，则第一轮所需裂解物的量计算如下
required volume er
librarytit amplified ty multiplici ts recombinan primary =⨯）
（
mL mL
33.0/pfu 103100
pfu 101119=⨯⨯⨯
3、 配制100mL 的1×TBST （10mL 10×TBST + 90mL 去离子水）；
4、 每孔加100μL 噬菌体裂解物, 室温孵育30min ；
5、 用1×TBS 洗板子5次。

也可用真空洗板机或每孔加入多于200μL 的
Buffer ，短暂孵育，倒出buffer ，拍干；
6、 加入200μL T7抽提液，抽提结合的噬菌体，室温孵育10-20min ；
7、 将噬菌体抽提液收集在15mL 无菌管中；
8、 将250μL 抽屉的噬菌体添加到50mL 宿主菌培养液中（第一步中制备
的），37℃摇至裂解（1-3h ）；
9、 将裂解培养物收集在50mL 离心管中，8000g ，10min 。

收集上清，4℃
保存备用（下次筛库用）。