HBsAg阳性肝癌患者预后及病理因素与ALK基因表达的相关性研究

HBsAg阳性肝癌患者预后及病理因素与ALK基因表达的相
关性研究
刘建化;金浩生;田红霞;张绪超;马冬
【摘要】目的:检测ALK基因在HBsAg阳性肝细胞癌患者中的表达,并分析其与临床特征及预后的相关性.方法:收集我院2005～2010年261例术后经病理确诊的HBsAg阳性肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织标本,采用免疫组织化学法和FISH法对标本石蜡切片进行分析,检测ALK表达情况,并探讨其对HBsAg阳性肝癌患者临床病理因素和预后的影响.结果:在肿瘤组织中,免疫组织化学法和FISH法分别检测到ALK阳性表达率为44.8％和32.6％.免疫组化结果进一步显示ALK蛋白表达与患者性别、肿瘤数目和微转移密切相关(P＜0.05),而与患者的年龄、AFP水平、肿瘤大小、临床分期等无关;ALK阳性患者总生存期和无进展生存期均明显低于阴性患者(P＜0.01);多因素分析显示,ALK表达和微转移是对患者无进展生存期具有统计学显著性的预后因素.结论:ALK在HBsAg阳性肝癌组织表达状态与肝癌的生长和转移关系密切,可以作为反映肝癌生物学行为和判断预后的有效指标.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2016(032)005
【总页数】6页(P841-846)
【关键词】ALK基因;HBsAg;肝细胞癌
【作者】刘建化;金浩生;田红霞;张绪超;马冬
【作者单位】广东省人民医院/广东省医学科学院胃肠肿瘤内科,广东广州510180;广东省人民医院/广东省医学科学院肝胆外科,广东广州510180;广东省人民医院/
广东省医学科学院肺癌研究所,广东广州510180;广东省人民医院/广东省医学科学院肺癌研究所,广东广州510180;广东省人民医院/广东省医学科学院胃肠肿瘤内科,广东广州510180
【正文语种】中文
【中图分类】R363;R730.23
原发性肝细胞癌(以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发病例约为78.2万，其中男性肝癌发病率位居第5位而女性居第9位[1]。

我国属于肝癌高发国家，年发病及死亡病例数均占到全球50%，严重危及人民健康，而慢性乙型
肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的慢性肝炎和肝硬化则是最主要致病
因素[2]。

肝癌预后差，其传统治疗方法包括介入、化疗、放疗等，效果均不理想，近年来随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，特异性高且不良反应轻的分子靶向药物日益成为研究焦点。

索拉非尼是一种口服的多靶点、多激酶抑制剂，美国食品药品监督管理局于2007年批准用于晚期肝癌的一线治疗，可延长晚期肝癌患者生存时间，具有良好的临床疗效和安全性；但近年来索拉非尼导致的原发或继发耐药逐渐增多，生存期延长有限，寻找肝癌新的治疗靶点显得尤为重要。

间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)属于胰岛素受体超家族，编码一个跨膜受体酪氨酸激酶；它的激活影响肿瘤细胞的增殖分化与凋亡，在肿瘤发生、发展中起着重要作用[3]。

ALK基因异常通常包括基因易位、扩增、点突变
以及过表达，其中染色体易位形成的ALK融合基因是恶性肿瘤中最常见的ALK畸变。

目前研究已证实[4]ALK可与ATIC、TFG、CLTC、EML4、NPM等多种基因
发生融合，ALK融合基因触发ALK激酶持续活性，成为癌基因依赖途径。

针对
ALK融合基因的小分子抑制剂克唑替尼(crizotinib)已经作为ALK阳性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)一线治疗首选，其较高的客观有效率更是开创了靶向治疗里程碑。

迄今为止，ALK基因异常在多种实体瘤中已有报导，比如乳腺癌[5]、结肠癌[6]等，同时证实ALK基因异常与恶性肿瘤发展有相关性。

但目前鲜有研究探索肝癌中ALK基因的表达情况及临床意义。

本文基于免疫组化和FISH方法，以确诊为HBsAg阳性肝癌患者的石蜡包埋组织切片为研究对象，检测肝癌中ALK基因的表达，并评价其临床病理特征，探讨其能否作为判断预后及指导靶向药物治疗的一项辅助检测手段。

1 材料
收集2005年6月～2010年10月广东省人民医院共261例经病理学证实的HBsAg阳性肝癌组织标本和距离病灶边缘2 cm的癌旁组织标本，所有患者术前均未接受化疗和放疗；所有病理标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，有明确的起始时间(手术时期)、终点时间及终点状态(生存、死亡)，死亡患者有明确的死亡时间、死因记录。

研究对象纳入标准：(1)血清学检查HBsAg阳性，病理学诊断为肝细胞癌；(2)有充足的病理学标本，临床资料齐备；(3)每个患者均已签知情同意书,其中男性225例(86.2%)，女性36例(13.8%)，年龄21～82岁，平均52岁。

存活组81例，中位生存期45.0月；死亡组180例，中位生存期35.0月。

总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression-free survival，PFS)分别定义为随机分组开始至死亡/随访结束以及局部复发/远处转移/随访结束。

肝癌微转移是指肿瘤进程中播散并存活于血循环、骨髓等组织器官的微小肿瘤细胞灶，本研究根据病理科采用PCR技术对肝癌、癌旁组织和患者外周血检测的AFP mRNA 结果判定：AFP的mRNA可作为肝细胞癌标记基因，即检测到AFP的mRNA说明肿瘤细胞存在，患者出现微转移。

肿瘤的临床病理分期依据2002年国际抗癌联盟所定的肝癌TNM分期法。

2 试剂
兔抗人ALK单克隆抗体购自CST；Ⅱ抗SP免疫组化试剂盒购自北京中杉公司；LSI ALK双色分离探针购自Vysis；胃蛋白酶反应液购自Sigma。

3 实验方法
3.1 免疫组化每个蜡块取4 μm厚连续切片，将切片放于二甲苯中脱蜡，乙醇
梯度水化处理，3%的过氧化氢去离子水消除内源性过氧化物酶，EDTA(pH 8.0)修复液常规修复以充分暴露抗原位点。

待其自然冷却后，加封闭液室温封闭15 min，兔抗人ALK(1∶50)4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次5 min，后加 II 抗室温孵育15 min，PBS 漂洗3次，每次5 min，加链霉卵白素室温孵育
15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次5 min，DAB显色10 min，终止显色，苏木素复染，盐酸乙醇固定，中性树胶封片，观察。

实验结果由2位病理科
医生在双盲情况下观察组织标本的着色程度所得，ALK蛋白阳性表现为细胞浆内
呈现棕褐色染色，高倍镜下(×200)随机取4个不同视野，评分如下：≥10%肿瘤
细胞中无染色为(-)，微弱的胞浆染色为(+)，中度光滑的胞浆染色为(++),重度颗粒状胞浆染色为(+++)。

3.2 FISH 作为诊断ALK基因状态的金标准，我们对261例病理切片标本进行FISH检测。

具体实验步骤按照说明书进行：切片脱蜡、脱水，肿瘤区域滴加4
g/L胃蛋白酶反应液(1∶10 000)，消化15 min；再脱水，室温晾干；随后切片加入5 μL稀释的ALK探针，变性，放入预热的杂交盒中过夜；次日清洗、干燥，滴加适量DAPI复染剂到杂交区域，观察结果。

ALK易位阳性定义为：计数100个
完整细胞，其中≥15%细胞红绿信号分离或者出现单红信号。

然而目前ALK拷贝
数增加尚无明确定义，本文参考了Pietrantonio等[7]在结肠癌研究中的结果判定标准：计数细胞中≥10%的细胞里出现3～5 ALK拷贝数称为ALK拷贝数增加，出现≥6 ALK拷贝数称为ALK基因扩增。

4 统计学处理
应用SPSS 10.0软件包进行统计学分析。

ALK蛋白表达情况与其临床病例关系的比较采用2检验，生存率采用Kaplan-Meier法计算，生存期差别的比较采用Log-Rank时序检验。

Cox比例风险模型评估影响患者生存的各变量，以P<0.05为差异有统计学意义。

1 免疫组织化学检测到ALK蛋白在HBsAg阳性肝癌组织中的表达
在261例HBsAg阳性肝癌组织标本中检测出117例呈ALK蛋白阳性，表现为不同程度的棕色胞浆染色，其阳性率为44.8%，而癌旁组织中未检测到ALK表达或仅有微弱表达，见图1。

2 FISH检测ALK状态
在所有261例HBsAg阳性肝癌和癌旁标本中，均未检测到ALK易位或扩增，然而有85例肝癌标本检测出ALK基因拷贝数增加(这里称之为FISH阳性)，阳性率为32.6%，而癌旁组织标本呈阴性。

在85例FISH阳性的肝癌标本中，82例的IHC检测也为阳性，见图1。

3 ALK蛋白表达与临床病理关系
本研究探讨了ALK表达与HBsAg阳性肝癌患者的临床病理联系，相对于DNA和RNA，蛋白表达更稳定，其结果更有可比性，所以我们的数据分析均基于IHC检测结果，见表1。

Crosstabs分析及Chi-Square Tests分析可见ALK蛋白表达与患者性别、肿瘤数目和微转移密切相关(P<0.05)；即男性、多发肿瘤(肿瘤数目≥2个)、有微转移患者的ALK阳性表达率明显高于女性、单发肿瘤、无微转移患者。

而与患者的年龄、AFP水平、肿瘤大小、临床分期等无关。

4 ALK与术后生存率的关系(Kaplan-Meier生存分析)
截止到2013年6月1日随访结束，69.0%(180/261)的HBsAg阳性肝癌患者死亡，均死于肿瘤复发或转移，中位随访时间36.0月(0.6～78月)，11例(4.2%)患
者失访。

本研究进一步评估了ALK基因对HBsAg阳性肝癌患者预后生存的影响。

结果显示ALK阴性患者的OS和PFS均明显高于ALK阳性患者(P<0.05),见图2。

5 影响HCC预后的Cox分析
利用Cox比例风险模型对可能影响HBsAg阳性肝癌预后的多因素进行分析, 包括年龄、性别、AFP水平、肝硬化、肿瘤大小、肿瘤数目、临床分期、血管侵犯、
微转移、ALK蛋白表达，结果见表2。

单因素和多因素分析结果表明，ALK蛋白
表达是HBsAg阳性肝癌患者PFS的独立预后因子(P<0.05)，然而对患者的OS无显著影响。

肝癌是一种临床和病理都异质性极高的恶性肿瘤，其发生、发展、转移与多种基因突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等密切相关，尽管目前的临床研究已经取得很大进展，但其发病机理尚不完全清楚，总生存率提高甚微。

因此加强肝癌病因学研究，找出其发生发展过程中起关键作用的相关基因，探索分子靶向治疗的潜在靶点至关重要。

目前研究中较为肯定的可以作为肝癌分子靶点相关基因包括EGFR、TGF-β、c-MET等[8]。

近年来，ALK基因已经引起广泛关注，其异常与人类肿瘤的恶性转化密切相关，特别是ALK抑制剂治疗EML4-ALK阳性NSCLC的
高有效率更成为肿瘤治疗上一个里程碑，大量研究对多种实体瘤中ALK基因状态
进行探讨。

我们希望在此基础上，通过进一步检测ALK基因与肝癌发生发展和预
后关系，根据其在肝癌中的作用，找出新的分子诊断、靶向治疗和预后判定新方法，从而在基因水平实现肝癌个体化治疗。

本研究对261例HBsAg阳性肝癌患者组织标本的ALK基因状态进行检测，旨在
观察肝癌中是否普遍存在ALK表达或者基因变异(包括易位、扩增、突变)，并探
讨其与临床病理及预后之间的关系。

IHC和FISH检测分别显示ALK蛋白高表达(44.8%)，ALK基因拷贝数增加(32.6%)，并且2种检测结果具有一致性；85例FISH阳性标本中，82例IHC检测也为阳性，而FISH检测特异性更高(97.9%)，
这与Wu等[9]的研究结果相似。

然而值得注意的是，ALK蛋白高表达或者ALK基因拷贝数增加并不意味着存在ALK基因易位。

有研究发现[10]，在NSCLC患者中，ALK基因拷贝数增加或扩增比较普遍，但是ALK基因易位却罕见，仅占全部患者
的3%～5%；类似的结果在鼻咽癌中也得到证实[11]。

最近，一项回顾性研究[12]也观察到ALK基因拷贝数增加在肝癌患者中比较常见(阳性率13.15%)，但是不存在ALK基因变异。

这里，我们的实验均未检测到ALK基因位点易位、扩增、突变，与上述研究结果一致，同样也提示ALK基因在HBsAg阳性肝癌中上调，是肝癌
一个新的分子标志物。

本研究进一步探讨了ALK蛋白与HBsAg阳性肝癌临床病理参数之间的关系，结
果表明ALK蛋白表达与患者性别、肿瘤数目和微转移密切相关，也就是说，ALK
在男性、多发肿瘤、存在微转移的患者中明显高于女性、单发肿瘤、无微转移者，提示ALK在肝癌发生、发展、浸润、转移过程中起到重要作用，ALK阳性的肝癌
有可能具有更强的侵袭性。

过去几年，大量的实验模型系统已经充分证实ALK基
因过表达与肿瘤浸润转移相关基因相互作用，在转录或翻译水平调控肿瘤的侵袭，最终导致器官浸润、肿瘤扩散[13]。

此外，邵春奎等[14]也曾报道ALK蛋白在肝
癌过表达，并与肿瘤发展相关，但是该研究涉及病例数仅有2例，未做进一步统
计分析。

我们的实验数据表明ALK过表达在HBsAg阳性肝癌发展、转移中起着
至关重要的作用。

众所周知，原癌基因激活和肿瘤抑制子失活是恶性肿瘤发生、发展基础，确切地说，ALK癌基因由它内源性配体肝素结合细胞因子(midkine，MK)和多效生长因子(pleiotrophin，PTN)激活，这两个配体在肿瘤细胞中促进有丝分裂和血管生成。

激活的ALK基因高表达于肝癌细胞中，触发一个下游信号级联复杂系统，包括
PI3K/AKT和MAPK旁路，引起一系列细胞生物学变化，介导调控细胞增殖、运
动和凋亡。

因此，ALK基因在驱动体内、外肿瘤发生发展过程中具有重要作用[7,
13]。

最近Hasan等[13]研究阐明成神经细胞瘤里，作用于肿瘤进程中关键性增殖通路的MYC蛋白同时调控ALK基因，使遗传稳定性发生改变，干扰细胞正常活
动而发生肿瘤，这在另一方面证实ALK基因等致癌作用。

有趣的是，Di Paolo等[15]也观察到在成神经细胞瘤中，使用RNA干扰敲除ALK，不论是否存在基因融合，都会导致肿瘤细胞增殖下调、凋亡上调，最终抑制患者肿瘤生长，延长生存。

综上所述，ALK基因参与了HBsAg阳性肝癌的发展、转移过程，可作为临床监测病情的一个重要指标。

近年来，研究已证实[15]，多种人类恶性肿瘤中ALK基因过表达常预示预后不良，如乳腺癌、基底细胞癌、成纤维细胞瘤等。

同样，本研究发现在HBsAg阳性肝癌中，ALK蛋白阳性组的OS和PFS明显低于阴性组，且COX分析也表明ALK蛋
白表达是影响患者PFS的不良预后因素。

但是Jia等[12]关于肝癌的研究中，所得结果却与我们相反，其数据显示ALK基因拷贝数增加可以预测HBsAg阴性肝癌
患者预后生存，然而对HBsAg阳性患者无影响。

这种差异可能原因是入组患者遗传背景不同以及研究方法有异。

总之，ALK蛋白表达上调是HBsAg阳性肝癌患者预后不良的标志。

由于本研究属于回顾性分析，研究过程中部分患者临床资料失访，特别是肝癌术后未再入院治疗的病人，不可避免引起潜在偏差。

因此，我们需要进行更多的体内外试验证实上述结果。

此外，是否ALK抑制剂能够有效治疗ALK蛋白过表达的HBsAg阳性肝癌患者尚未明确，有待进一步研究。

综上所述，ALK基因有可能成为HBsAg阳性肝癌患者转移和预后不良的一个新的预测因子，影像学诊断联合ALK基因检测有助于判断新发肝癌病例预后，ALK有
可能成为肝癌治疗中新的分子靶点。

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