转录调节因子FoxO3a对小鼠Mac-1+细胞功能的影响

Mac-1 + 4. 6 ± 2. 0 20 ± 71）
2. 2 Mac-1 + 细胞内炎性细胞因子 S100A8 和 S100A9 基因表达 明显高于对照鼠 利用流式细胞分选技术从各组小鼠脾细胞 中获得高纯度的 Mac-1 + 细胞，纯度达到 99% 。Real-time PCR 结果显示基因敲除鼠脾脏 Mac-1 + 细胞内的 S100A8 和 S100A9 mRNA 表达（ 9. 34 ± 1. 31，11. 5 ± 1. 12） 分别是野生型小鼠（ 1. 36 ± 0. 31，1. 00 ± 0. 08） 的 6. 87、11. 5 倍，明显高于对照鼠。 2. 3 FoxO3a 基因敲除鼠脾脏 S100A8、S100A9 蛋白表达明显 高于 正 常 对 照 鼠 由 于 脾 细 胞 中 S100A8 和 S100A9 仅 在 Mac-1 + 细胞中表达，分别制备了 FoxO3a 基因敲除鼠及对照鼠 的脾细胞溶解液。基因敲除鼠较野生型鼠 S100A8（ 9. 86 ± 1. 33 vs 1. 02 ± 0. 27） 和 S100A9 基因（ 8. 78 ± 1. 31 vs 1. 14 ± 0. 10） 分 别高出 9. 86、8. 78 倍。Western 印迹分析显示基因敲除鼠脾细 胞中 S100A8、S100A9 的蛋白表达亦明显增加。在脾细胞各组 份中，仅有 Mac-1 + 细胞表达 S100A8 及 S100A9 基因。基因敲 除鼠脾细胞、野生型鼠 Mac-1 + 细胞和基因敲除鼠 Mac-1 + 细胞 的 S100A9 mRNA 表达（ 8. 78 ± 1. 31、2. 81 ± 0. 22、32. 33 ± 3. 15） 分别为野生型小鼠脾细胞 S100A9 mRNA 检出量（ 1. 14 ± 0. 10） 的 8. 78、2. 91、31. 9 倍，而其他各细胞组分的检出量近似于 0。 同时，基因敲除鼠脾细胞、野生型小鼠 Mac-1 + 细胞和基因敲除 鼠 Mac-1 + 细 胞 的 S100A8 mRNA 表 达 （ 9. 86 ± 1. 33、13. 25 ± 12. 74、90. 82 ± 30. 98） 分别为野生型小鼠脾细胞 S100A8 mRNA 检出量（ 1. 02 ± 0. 27） 的 9. 86、13. 5 和 87. 6 倍，而其他各细胞组 分的检出量接近于 0。见图 1。 2. 4 S100A8 和 S100A9 基因启动子部位未发现已知的 FoxO 的 DNA 特异性识别序列 由于 FoxO3a 基因缺失导致 Mac-1 +
7. 3 ± 1. 0 14 ± 4. 91）
CD3 + 22 ± 4. 9 45 ± 5. 31）
B220 + 28 ± 8. 1 57 ± 111）
计数（ × 106 ） CD4 +
11 ± 2. 7 22 ± 4. 21）
CD8 + 8. 3 ± 2. 5 17 ± 2. 21）
与野生型组比较： 1） P ＜ 0. 05
4s100a8和s100a9基因启动子部位未发现已知的foxo的dna特异性识别序列由于foxo3a基因缺失导致mac1细胞中s100a8和s100a9mrna的表达异常升高为了明确foxo3a是否直接参与s100a8和s100a9基因的表达调控对小鼠s100a8和s100a9基因转录起始点上游500bp的基因序列进行分析未发现有dna识别序列gctaaaactaa仅显示了小鼠s100a8基因转录起始点上游91bp序列和s100a9基因转录起始点上游80bp序列
表 1 FoxO3a 基因敲除鼠与野生型小鼠脾细胞构成比较（ x ± s）
组别
野生型组 基因敲除组
总数（ × 106 ） CD3 + （ % ）
61 ± 17. 0 148 ± 14. 01）
37 ± 3. 5 31 ± 5. 0
B220 + （ % ） Mac-1 + （ % ）
46 ± 1. 3 38 ± 6. 4
年口腔疾病的治疗研究。
FITC-anti-B220（ RA3-6B2） 和 PE-anti-CD11b（ M1 /70） 三组抗体 进行 染 色，用 含 0. 05% NaN3 及 4% FBS 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ PBS） 洗涤细胞 2 次，用 40 μm Nylon Mesh（ BD Falcon 公司） 过 滤后，将细胞悬浮于含 5 μg / ml 碘化丙啶（ PI，Sigma 公司） 的上 述缓冲液中，以上抗体均购自美国 BD Pharmingen 公司。用流 式细胞仪 FACSCalibur（ 美国 BD Biosciences 公司） 对染色后细 胞进行分析。 1. 2. 3 细胞分选 收集 40 × 107 个脾细胞，用 FITC-anti-B220 （ RA3-6B2） 和 PE-anti-CD4（ RM4-5） 抗体染色后，使用日本 Bay Bioscience JSAN 流式细胞分选仪获得 CD4 + T 细胞和 B 细胞， 纯度分别为 98. 5% 和 98. 7% 。回收未着染细胞，用 FITC-antiB220（ RA3-6B2） 和 PE-anti-CD11b （ M1 /70） 抗体染色后，使用 上述分选仪获得 Mac-1 + 细胞，纯度为 99% 。回收未着染细胞， 用 FITC-anti-CD8（ 53-6. 7） 和 PE-anti-CD4（ RM4-5） 抗体染色后， 使用上述分选仪获得 CD8 + T 细胞，纯度为 98. 7% 。 1. 2. 4 RNA 提取及 Real-time PCR 取 1 × 107 个细胞，用 PBS 洗涤 2 次，溶于 1 000 μl TRIzol Reagent（ Invitrogen 公司） 中，提 取总 RNA。使用反转录试剂盒（ Promega 公司） 合成 cDNA。使 用 QuantiTect SYBR Green PCR Kit（ QIAGEN 公司） 对目标基因 mRNA 表 达 进 行 定 量。 S100A8 上 游 引 物： 5'-ATACAAGGAAATCACCATGC-3'； 下 游 引 物： 5'-TACTCCTTGTGGCTGTCTTT-3'； S100A9 上 游 引 物： 5'-AGCAAGAAGGAATTCAGACA-3'； 下游引 物： 5'-TCAGCATCATACACTCCTCA-3'； EF1a 上 游引物： 5'-TGCTGCCATTGTTGATATGG-3'； 下游引物： 5'-TCCACAGCTTTGATGACACC-3'。PCR 条 件 为： 95℃ 预 变 性 10 min； 95℃ 15 s，55℃ 25 s，72℃ 10 s，40 个循环； 72℃ 延伸 5 min，结 束反应，4℃ 保存。 1. 2. 5 Western 印迹 取 1 × 107 个脾细胞，用冷 PBS 洗涤 2 次，溶解于 500 μl IP Kinase 液（ 150 mmol / L Nacl，2. 5 mmol / L EGTA，1 mmol / L EDTA，50 mmol / L HEPES，0. 1% Tween-20， 10% glycerol） 中，经 超 声 波 破 碎 后 获 得 脾 细 胞 溶 解 液，使 用 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（ Thermo Pierce 公司） 对蛋白质进 行定量。等量样品进行 7. 5% 和 12. 5% 十二烷基硫酸钠-聚乙 烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE） ，电转移至聚偏二氟乙烯（ PVDF） 膜（ Millipore 公司） 。5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入一抗 AntiFOXO（ Upstate 公司#06-951，1∶ 1 500） 或 Anti-S100A9（ abcam 公
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中国老年学杂志 2012 年 12 月第 32 卷
司 ab75478，1 ∶ 1 000） ，4℃ 过夜。用含 0. 05% Tween-20 的 PBS 溶液 洗 涤 3 次 各 10 min 后 加 入 二 抗 Anti-rabbit （ Sigma， 1∶ 4 000） ，室温孵育 30 min，再用上述 PBS 溶液洗涤 3 次，最后 使用增强化学发光法（ ECL） 发光试剂盒（ Thermo Pierce 公司） 和 X 光胶片（ 柯达公司） 显色。一抗还包括 Anti-tubulin（ Sigma T6557，1∶ 2 000） 。
1. 3 统计学方法 应用 SPSS10. 0 统计软件行 t 检验。
2结果 2. 1 FoxO3a 基因缺失导致小鼠脾脏中 Mac-1 + 细胞数明显增 加 基因敲除鼠的肺及皮下等组织内可见大量炎性细胞浸润， 脾脏随年龄增加而明显肥大。流式细胞术分析。发现 FoxO3a 基因敲除鼠脾细胞总数明显增加（ P ＜ 0. 05） ，其中 T、B 淋巴细 胞表现了相同比例的增加（ P ＜ 0. 05） ，而 Mac-1 + 细胞数量及百 分率的增加更加明显（ P ＜ 0. 05） 。见表 1。
1 材料与方法 1. 1 动物 FoxO3a 基因敲除鼠由日本长寿医疗研究中心提 供，所有小鼠均为 C57BL /6 品系。基因敲除鼠的建立参见文 献〔4〕。所有实验均选取适龄雌性小鼠。对照小鼠均为与基因 敲除鼠 同 窝 出 生 的 野 生 型 鼠。所 有 小 鼠 在 无 特 定 病 原 体 （ SPF） 级动物室饲育，实验严格遵守动物实验伦理要求。 1. 2 方法 1. 2. 1 脾 细 胞 制 备 颈 椎 脱 臼 处 死 小 鼠，取 脾 脏 放 入 4℃ Hank 液（ Sigma 公 司） 中，置 于 100 μm 无 菌 细 胞 过 滤 网 （ BD Falcon 公司） ，用注射器针芯研压脾脏，获得脾细胞悬液，离心 后弃上清，加入红细胞裂解液（ EDTA-NH4 Cl） 置于冰上1 min， 立即用 10% 胎牛血清（ FBS） RPMI 培养液（ Gibco 公司） 洗涤细 胞 2 次后，将细胞悬浮于 10% FBS RPMI 培养液中。所有离心 条件均为 1 200 r / min，5 min。 1. 2. 2 细胞染色 取脾细胞 3 × 105 ，分别用异硫氰酸荧光素 （ FITC ） -anti-CD8 （ 53-6. 7 ） 和 聚 乙 烯 荧 光 素 （ PE ） -anti-CD4 （ RM4-5） 、FITC-anti-B220（ RA3-6B2） 和 PE-anti-CD3（ 17A2） 及
转录调节因子 FoxO3a 对小鼠 Mac-1 + 细胞功能的影响
王若立 陈 晨1 罗 红1 孙文平1 杨 光1 （ 大连市友谊医院，辽宁 大连 116001）
〔摘 要〕 目的 探讨 FoxO3a 基因缺失对于小鼠 Mac-1 + 细胞功能的影响。方法 采用流式细胞术计数 FoxO3a 基因敲除鼠及对照野生型鼠 脾细胞中 Mac-1 + 细胞数量及百分率。采用流式细胞分选技术分离脾细胞中 Mac-1 + 细胞，利用 Real-time PCR 和 Western 印迹检测 Mac-1 + 细胞中的 炎性细胞因子 S100A8、S100A9 的表达水平。结果 FoxO3a 基因敲除鼠的脾细胞中 Mac-1 + 细胞数明显增加，细胞内 S100A8 和 S100A9 的基因及蛋 白表达明显高于野生型鼠。结论 FoxO3a 可能有抑制 Mac-1 + 细胞过度活化、维持其稳态的作用。
〔关键词〕 转录调节因子； FoxO3a； Mac-1 + 细胞； 炎性反应； 免疫调节
〔中图分类号〕 R392. 12 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2012） 24-5471-03； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 24. 047
叉头转录因子（ FoxO3a） 属于转录因子 FoxO 家庭的成员， 在维持免疫系统稳态上发挥重要作用〔1，2〕。FoxO3a 基因缺失 导致小鼠 T 细胞内细胞核转录因子（ NF） -κB 活性增高，引起 T 细胞自发性增殖和多组织器官的慢性炎性细胞浸润〔3〕。慢性 炎性病变局部主要以单核巨噬细胞浸润为主，产生大量炎性趋 化因子诱导炎性细胞进一步浸润。目前关于 FoxO3a 是否参与 单核巨噬细胞的分化及功能调控尚不十分清楚。本研究探讨 FoxO3a 基因缺失对于巨噬细胞功能相关抗原-1（ Mac-1 + ） 细胞 分化动基金、辽宁省教育厅高校科研项目 （ No. 2009A196） ； 教育部科技发展中心博士点专项科研基金 （ No. 20112105120009）
1 大连医科大学检验医学院 通讯作者： 陈 晨（ 1973-） ，女，博士，讲师，主要从事免疫细胞生物学基
础研究。 第一作者： 王若立（ 1966-） ，男，主任医师，主要从事免疫基础研究及老