祛风解痉方药对哮喘模型小鼠气道高反应性及气道炎症的影响

祛风解痉方药对哮喘模型小鼠气道高反应性及气道炎症的影响樊长征; 苗青; 崔云; 何沂; 张琼; 张文江; 樊茂蓉
【期刊名称】《《环球中医药》》
【年(卷),期】2019(012)011
【总页数】5页(P1640-1644)
【关键词】祛风解痉方药; 哮喘小鼠模型; 气道炎症; 气道高反应性; Smith评分
【作者】樊长征; 苗青; 崔云; 何沂; 张琼; 张文江; 樊茂蓉
【作者单位】100091 北京中国中医科学院西苑医院呼吸科
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
支气管哮喘(以下简称哮喘)是由多种细胞和细胞组份参与的气道慢性炎症性疾患。

Th1/Th2失衡是其主要的免疫学改变，也是哮喘发生发展的关键。

众多细胞和因
子影响Th1/Th2应答平衡，其中广泛存在于皮肤粘膜组织的γδT细胞，因其存在的部位及其独特的生物学特性，使其与哮喘相关性的研究越来越受到重视[1-2]。

气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)是一种反映哮喘患者气道功
能异常状态的关键指标之一，在哮喘诊断及哮喘患者的病情和预后评估中具有重有意义[3]。

“风盛痰阻，气道挛急”既是哮喘发作的病因，又是哮喘发病之结果，“风盛痰阻，气道挛急”的状态贯穿于哮喘的发作期、缓解期、稳定期整个病程中，这与哮喘重要特征气道高反应性存在高度一致，因此课题组认为气道高反应与“风
盛痰阻，气道挛急”密切相关[4]。

祛风解痉方药依据哮喘气道高反应性的关键病
因病机“风盛痰阻，气道挛急”而组成，前期临床试验显示其可明显改善哮喘气道高反应性患者临床症状，较好控制哮喘发作，改善哮喘气道阻塞，是防治哮喘患者气道高反性的有效方法。

基于此，本课题组进行动物实验，探索了祛风解痉方药对哮喘小鼠气道阻力及肺组织病理学影响。

1 材料与方法
1.1 试验动物
6～8周雄性Balb/c小鼠，购自湖北省动物实验中心，许可证号：SYXK(鄂)2013-0069。

1.2 试验试剂
卵清蛋白(ovalbumin，OVA)：美国Sigma，批号:A5503-1G；氢氧化铝[aluminum hydroxide，AL(OH)3] : 美国Sigma，批号:V900163-500G；苏木素：福州迈新生物，批号:CTS-1099；伊红:北京索莱宝，批号:G1100；核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取试剂盒:日本SBI，批号:RA808A-1；逆转录试剂盒:南京诺唯赞生物科技有限公司，批号:R101-01/02；定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)试剂盒，全式金，北京酷来搏科技有限公司，批号:AQ131-01；祛风解痉方：中国中医科学院西苑医院中药房；醋酸泼尼松片：天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020123，5 mg/片。

1.3 主要仪器
动物肺功能检测系统，北京贝兰博科技有限公司，货号:AniRes2005；实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf，货号:X226488N。

1.4 模型制作
在无菌环境中饲养适应1周后，进行第一次致敏，腹腔内注射20 μg OVA和2 mg AL(OH)3；第二周后进行第二次致敏，腹腔内注射10 μg OVA和1 mg
AL(OH)3；第三周后进行第三次致敏，腹腔内注射10 μg OVA和1 mg AL(OH)3；第五周开始每天用0.5×PBS配制的5%OVA 40～50分钟滴鼻处理。

正常对照组
致敏用生理盐水，滴鼻处理用0.5×PBS，连续7天，7天后评估模型是否成功。

1.5 分组设计
实验共分成6组，每组5只。

设空白对照组：不造模，给予等体积生理盐水灌服；模型组：造模后，给予等体积生理盐水灌服；中药低剂量组：造模后，给予1倍
剂量中药灌服；中药中剂量组：造模后，给予2倍剂量中药灌服；中药高剂量组：造模后，给予4倍剂量中药灌服；阳性对照组：造模后，给予1倍剂量激素灌服。

1.6 给药方案
祛风解痉方具体药物组成：炙麻黄9 g、杏仁10 g、防风10 g、地龙12 g、蝉衣10 g、柴胡9 g、苍耳子6 g、乌梅6 g、陈皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g，混合煎煮药汁过滤蒸发、浓缩。

给药量根据人与小鼠体表面积换算方法计算，按人体每日用药量的1倍、2倍、4倍剂量给药。

醋酸泼尼松片(5 mg/片)，给药
量根据人与小鼠体表面积换算方法计算，按人体每日用药量的1倍剂量给药。

模
型成立后，第2天开始灌胃给药，饲料正常。

连续用药14天。

1.7 实验指标的观察测定
1.7.1 肺组织病理学检测取肺组织病理切片作苏木精—伊红染色(HE染色)，观察
肺组织的病理学改变，采用Smith评分方法[5]评估肺部病变程度。

表1 引物序列信息基因上游引物下游引物GAPDHCGAGAATGGGAAGCTTGTCACGAGAATGGGAAGCTTGTCA
Vγ1GATGAGAGTGCGCAAATATCCGGGTCGTTGATTGTAGTTTGTT
Vγ4TATCAATTTCCAGAGCAAGAGAGTAGGGGTTGCAAGGACAT
即分别对肺水肿、肺泡和肺间质炎性细胞浸润、肺泡和肺间质出血、肺不张的情况进行0～4分半定量分析：无损伤为0分，病变范围<25%为1分，病变范围
25%～50%为2分，病变范围>50%～75%为3分，病变范围>75%或满视野为4分，总肺损伤程度为上述各项得分总和。

1.7.2 气道反应性的测定各组小鼠注射麻醉后，行颈部气管插管，接呼吸机，呼吸频率75次/分钟，吸呼比1∶1，潮气量8 mL/kg，通过颈静脉先后间歇推注生理盐水0.5 mL以及0、6.25、1
2.5、25、50 mg/mL浓度梯度的乙酰胆碱0.5 mL，每次间隔约1分钟，用动物肺功能分析系统检测基础和用药后的气道阻力，以气
道阻力超过基础值2倍以上为停止乙酰胆碱推注的标准，以气道阻力的变化代表
气道反应性。

1.7.3 γδT细胞Vγ1、Vγ4表达检测取各组扩增10天γδT细胞，使用RT-PCR
检测Vγ1和Vγ4的表达。

RNA提取按试剂盒说明书操作，根据OD260/OD280
比值，估测RNA质量，比值在1.8～2.0之间满足实验要求。

根据吸光光度值按下列公式计算样品RNA的浓度：总RNA浓度(μg/ μL)=OD260×40×10-3。

将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。

逆转录试剂盒进行RNA逆转cDNA，SYBR Green qPCR试剂盒进行PCR扩增。

实时荧光定量PCR仪上机检测，进行归一化整理。

引物序列信息见表1。

1.8 统计学方法
所有数据采用SPSS 17.0软件统计分析处理，本试验数据经检验为正态分布，经
方差检验为方差齐。

符合正态分布且方差齐的计量资料用均数±标准差表示，组间进行单因素方差分析，以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 组织病理学结果
由结果显示，空白对照组小鼠肺组织保持正常的生理结构，组织内无炎症细胞浸润，肺泡结构完整。

与空白对照组相比，模型组小鼠的肺组织具有明显的炎性细胞浸润，基底膜增厚且形态不规则。

与模型组相比，中药治疗组在一定程度缓解肺组织的炎
性浸润情况，且治疗效果随着剂量的增加而更加显著。

与模型组相比，阳性对照组可缓解肺组织的炎性浸润情况。

见图1。

注：A: 空白对照组；B:模型组：C:中药低剂量组；D:中药中剂量组；E:中药高剂量组；F:阳性对照组。

图1 各组小鼠肺组织病理学结果(HE染色×10)
结果显示，与空白对照组相比，模型组的Smith评分显著升高(P<0.05)。

与模型
组相比，中药低剂量组的Smith评分无显著性差异(P>0.05)；而中药中剂量组、
中药高剂量组以及阳性对照组的Smith评分显著降低(P<0.05)。

见表2。

2.2 气道反应性结果
空白对照组小鼠状态良好。

模型组小鼠出现头、鼻部瘙痒，呼吸急促，活动量减少，毛发杂乱无光泽等症状。

根据小鼠的行为变化，中药高剂量组的小鼠症状改善效果最为明显。

因此，选择空白对照组、模型组、中药高剂量组、阳性对照组进行气道反应性检测。

由结果显示，呼吸波形图为肺功能流量—时间曲线，基线以上部分
为呼气相，基线以下部分为吸气相。

由结果可以看出，空白对照组小鼠的呼吸波形图规律且均匀，符合正常动物的生理状态。

与空白对照组相比，模型组的动物呼吸波形图的上升支和下降支的斜度减小并伴有顿挫，且呼吸周期之间伴有一段时间的基线段。

这表明模型组的小鼠呼气相和吸气相均明显延长，且伴有明显的呼吸不畅现象。

与模型组相比，中药高剂量组和阳性对照组的呼吸波形图中，上升支和下降支的斜度变大，呼吸周期之间的基线段消失，表明哮喘模型小鼠经过中药高剂量和阳性药物的治疗之后，呼吸不畅现象显著改善，见图2A。

通过颈静脉先后间歇推注生理盐水0.5 mL以及0、6.25、12.5、25、50 mg/mL浓度梯度的乙酰胆碱0.5 mL后各组小鼠的气道阻力结果。

结果显示，随着乙酰胆碱浓度的增加，各组
小鼠的气道阻力随之增加。

在同一乙酰胆碱浓度下，与空白对照组相比，模型组的
气道阻力显著升高；与模型组相比，中药高剂量组和阳性对照组的气道阻力显著降低，见图2B。

表2 各组小鼠肺组织HE染色Smith评分比较组别Smith评分95%置信区间下限上限空白对照组0.40±0.520.030.77模型组3.70±0.48adef3.354.04中药低剂量组3.60±0.52adef3.233.96中药中剂量组2.90±0.74abcef2.373.43中药高剂量
组2.00±0.67abcd1.522.5阳性对照组1.70±0.67abcd1.222.18
注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与中药低剂量组
比较，cP<0.05；与中药中剂量组比较，dP<0.05；与中药高剂量组比较，
eP<0.05；与阳性对照组比较，与fP<0.05。

2.3 γδT细胞Vγ1、Vγ4表达检测结果
结果如表3所示，与空白对照组相比，模型小鼠γδT细胞的Vγ1 mRNA表达量
显著增加、Vγ4 mRNA表达量显著减少(P<0.05)。

与模型组相比，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组以及阳性对照组的Vγ1 mRNA表达量显著降低、
Vγ4 mRNA表达量显著增加。

表3 各组小鼠肺组织γδT细胞Vγ1、Vγ4表达检测结果比较组别Vγ1 mRNA表
达量Vγ4 mRNA表达量空白对照组1.08±0.421.02±0.18模型组
6.01±0.64acdef0.15±0.03acdef中药低剂量组
4.50±0.37abdef0.38±0.03abdef中药中剂量组
3.45±0.52abcef0.53±0.06abcef中药高剂量组2.85±0.17abcd0.65±0.04abcdf 阳性对照组2.38±0.67abcd0.83±0.11abcdf
注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与中药低剂量组
比较，cP<0.05；与中药中剂量组比较，dP<0.05；与中药高剂量组比较，
eP<0.05；与阳性对照组比较，fP<0.05。

3 讨论
中医认为哮喘的主要病理机制为痰阻气道、肺失宣降、风盛痰阻、气道挛急等，现代医学认为哮喘的发病机制有气道炎症、变态反应、气道高反应性和神经因素等[6]。

气道高反应性是一种反映哮喘患者气道功能异常状态的关键指标之一，在哮
喘诊断及哮喘患者的病情和预后评估中具有重有意义，是指气道对刺激物的反应性增高，气道出现支气管平滑肌收缩、黏液分泌增多及免疫炎性介质释放，气道阻力上升和肺通气功能下降[7]。

β2激动剂与糖皮质激素是控制哮喘主要的药物，长期使用这些药物后部分患者出现激素抵抗，疗效下降，不能很好控制症状。

注：Control：空白对照组；Model：模型组；QFJJ：祛风解痉中药组；Prednisone Acetate：阳性对照组。

图2 各组小鼠肺功能检测波形图及气道阻力图
祛风解痉方药依据哮喘气道高反应性的关键病因病机“风盛痰阻，气道挛急”而组成，由炙麻黄、杏仁、防风、地龙、蝉衣、柴胡、苍耳子、乌梅、陈皮、半夏、茯苓、甘草，共12味药组成。

其中，炙麻黄为君药，杏仁、防风、柴胡、地龙、蝉衣为臣药，苍耳子、陈皮、半夏、茯苓为佐药，甘草、乌梅为使药。

该方药能够改善哮喘患者肺功能，降低易感性，降低呼吸道阻力，减轻机体对过敏因素的应激反应，可使肺之小气道由痉挛变为舒张，气道通顺，能够明显缓解哮喘气道高反应性，可明显改善哮喘气道高反应性患者临床症状，较好控制哮喘发作，改善哮喘气道阻塞，是防治哮喘患者气道高反性的有效方法[8-9]。

本研究发现各组小鼠的呼吸波形图和气道阻力的检测结果显示：高剂量中药组和阳性药物对照组可显著改善哮喘小鼠的呼吸不畅，呼吸迟缓现象，并且可显著降低哮喘小鼠的气道阻力。

气道炎症作为哮喘重要的发病机制，与气道高反应性关系密切。

Vγ1+γδT细胞能够减少肺组织中CD4+CD25+T细胞数量，进而降低细胞因子
IL-10和TGF-β的产生，而IL-10在免疫应答中起负调节作用，参与气道炎症的消
退和抑制气道高反应性[10-11]，在某些实验体系下，Vγ1+γδT细胞可能通过下调CD4+CD25+T细胞的生物学活性，促进过敏性哮喘的发生发展。

与Vγ1+γδT 细胞不同，Vγ4+γδT细胞主要通过分泌Th1型细胞因子IFN-γ，下调变应原诱导的Th2型应答，降低气道高反应性[12-13]。

本研究发现祛风解痉方药可以缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎性细胞浸润，γδT细胞的Vγ1 mRNA表达量显著降低、
Vγ4 mRNA表达量显著增加，表明祛风解痉方药可以显著缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎症反应，具有一定的治疗效果。

综上，本实验表明祛风解痉方药可改善哮喘小鼠模型气道高反应性，这与其抑制气道炎症及降低γδT细胞的Vγ1 mRNA表达量、增加Vγ4 mRNA表达量相关。

参考文献
【相关文献】
[1] LU H , LI D J , JIN L P . γδT Cells and Related Diseases[J]. American Journal of Reproductive Immunology, 2016, 75(6):609-618.
[2] BONNEVILLE M，O'BRIEN R L，BORN W K. Gammadelta T cell effector functions: a blend of innate programming and acpuired plasticity[J]. Nat Rev Irnrnunol，2010，10(7): 467-468.
[3] BRANNAN J D. Bronchial hyperresponsiveness in the assessment of asthma control: Airway hyperresponsiveness in asthma: its measurement and clinical significance[J]. Chest. 2010，138(S2): 11S-17S.
[4] 樊长征,焉石,李友林,等.祛风解痉法治疗哮喘病证源流考[J].时珍国医国药,2007，(12):2877-2878.
[5] SMITH K M,MROZEK J D,SIMONTON S C,et al.Prolonged partial liquid ventilation using conventional and high frequency ventilatory techniques:gas exchange and lung pathology in an animal model of respiratory distress syndrome[J]. Crit Care Med,1997,25(11):1888-1897
[6] 张雄飞,黄娟萍,李碧云,等.中药治疗哮喘作用机制的研究进展[J].中国实验方剂学杂
志,2013,19(15):344-347.
[7] RAPINO D，ATTANASI M，CONSILVIO N P，et al． Evaluation of association between airway hyperresponsiveness，asthma control test， and asthma therapy assessment questionnaire in asthmatic children [J]． Multidiscip Respir Med，2013，8(1):48.
[8] 樊长征,裴玉蓁,张文江,等.风邪恋肺在支气管哮喘慢性持续期中的认识和临床运用[J].中国医药导报,2016,13(1):102-105.
[9] 樊长征,裴玉蓁,丛晓东,等.祛风解痉方药对支气管哮喘患者气道高反应性的影响[J].中医杂
志,2018,59(24):2107-2110.
[10] HAHN Y S,JIX Y,WOO S I,et al.Vγ1+γδT cells reduce IL-10-producing CD4+CD25+T cells in the lung of ovalbumin-sensitized and challenged mice[J].Immunol Lett，2008，121(2):87-92.
[11] 曾胜,刘静,张雷英,等.γδT细胞在过敏性哮喘中作用研究的新进展[J].中国免疫学杂
志,2013,29(4):421-425.
[12] COOK L,MIYAHARA N,JIN N,et al.Evidence that CD8+dendritic cells enable the development of gammadelta T cells that modulate airway hyperresponsiveness[J]. J Immunol，2008，181(1):309-319.
[13] NAWIJN M C,MOTTA A C,GRAS R,et al.TLR-2 activation induces regulatory T cells and long-term suppression of asthma manifestations in mice[J].PLoS ONE，2013，8(2):e55307.。