湖北及山东地区栽培芋病毒病的田间调查及其病原的分子检测

湖北及山东地区栽培芋病毒病的田间调查及其病原的分子检测施世明;洪霓
【摘要】对湖北及山东地区种植的芋调查发现,田间芋病毒病发生普遍,症状表现主要有花叶、羽状斑驳、畸形皱缩、褪绿斑点等.2010年9月30日对武汉蔬菜科学研究所国家种质武汉水生蔬菜资源圃种植的芋进行调查发现,以上4种症状的田间显症率分别为26.92％,16.67％,28.21％和3.85％,田间调查时未发现蚜虫等媒介昆虫.对不同来源的芋叶片样品进行芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)的RT-PCR检测,各症状田间检出率为21.1％～42.9％.
【期刊名称】《长江蔬菜》
【年(卷),期】2011(000)016
【总页数】3页(P79-81)
【关键词】芋;病毒病;芋花叶病毒;田间调查;分子检测
【作者】施世明;洪霓
【作者单位】华中农业大学植物科学技术学院,湖北武汉,430070;华中农业大学植物科学技术学院,湖北武汉,430070
【正文语种】中文
芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]又名芋头、芋艿、毛芋等，为天南星科（Araceae）芋属（Colocasia）多年生宿根草本植物，原产于中国、印度和马来半岛等热带沼泽地区，现已在世界各国广泛种植。

芋是一种具有地域特色的水生蔬菜，主要以其膨大的肉质球茎供食用，有些种类的叶柄和花梗也可作蔬菜食用。

芋
属典型的无性繁殖作物，多采用球茎繁殖，在其长期的无性繁殖过程中，植株中病毒数量不断积累、种类不断增加，导致病毒病为害逐年加重，且品种退化严重，造成芋产量和品质下降。

随着我国芋种植面积逐步增大，芋病毒病在我国栽培芋上发生越来越普遍[1]，因此防治芋病毒病已引起人们的高度重视。

前期研究表明，侵染芋植株的病毒达8种之多[2～6]，国内报道的有芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）2种，其中DsMV分布最广，为害最大[6]。

本研究主要对湖北及山东种植芋的病毒病进行了相关田间调查，并对其主要病原病毒DsMV进行了RT-PCR检测，以期为生产实践提供参考。

1.1 芋病毒病田间调查
2010年4～11月对湖北武汉华中农业大学周边、蔡甸马家渡、蔡甸索河镇、武汉蔬菜科学研究所、仙桃、山东临沂等地种植的水芋及旱芋进行了田间调查并采集病样，选取武汉蔬菜科学研究所国家种质武汉水生蔬菜资源圃所种植的芋进行病毒病症状调查，记录不同症状显症株数并计算发生频率。

1.2 芋花叶病毒的RT-PCR检测
①样品来源从湖北及山东收集芋叶片样品共81份，其中多数样品植株的叶片表现花叶或羽状斑驳等症状。

②所用引物用于该病毒检测的引物为DsMV-1/DsMV-2：5'-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3'/5'-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3'，根据陈集双[7]的报道合成序列，其扩增片段为357 bp，扩增区域为cp基因中间部分核心序列；所用引物由上海生工生物技术有限公司合成。

③总RNA提取取待检材料嫩叶0.1 g，加液氮研磨成粉状，快速转入1.5 mL离心管中，加入1 mL RNA提取缓冲液（含50%异硫氰酸胍、5 mol/L苯酚等），剧烈混匀，室温静置5 min后离心，上清液经氯仿抽提2次后，加入2/3体积的异丙醇沉淀核酸，沉淀物经75%乙醇洗涤2次，风干后，溶于30 μL DEPC处理
水中，-20℃保存。

④RT-PCR 以提取的总RNA为模板，合成cDNA第1链，反应体系为20 μL，含5×反转录冲液4 μL、dNTPs（5 μmol/μL）1 μL、Rnasin（40 U/μL）0.5 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL、随机引物（100 pmol/μL）1 μL、RNA模板3 μL 和DEPC处理水10 μL。

PCR反应总体系为25 μL，含10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（5 μmol/μL）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、正反向引物各0.5 μL（10μmol/μL）、cDNA2μL和灭菌的去离子水18.8 μL。

扩增条件为：94℃变性3 min；然后94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后在溴化乙锭中染色10 min，最后凝胶成像、观察结果。

2.1 芋病毒病田间调查结果
调查发现田间芋病毒病发生普遍，发病重的田块田间病毒病显症率达50%以上。

芋从苗期（4月）到收获期（11月）的整个生长期内均表现出病毒病症状，其中在生长盛期（6～8月）症状表现最为明显。

症状表现主要有花叶、羽状斑驳、畸形皱缩、矮化、黄化、褪绿斑点等（图1），其中水芋表现以花叶为主，旱芋病症则表现多样。

2010年9月30日调查武汉市蔬菜科学研究所国家种质武汉水生蔬菜资源圃种植的旱芋病毒病症状统计情况见表1。

田间调查时未发现蚜虫等为害芋的媒介昆虫。

2.2 DsMV的RT-PCR检测结果
对来自湖北的79份芋叶片样品进行了DsMV的RT-PCR检测，部分样品中检测到357 bp的目标片段（图2），对目标片段进行回收、克隆、测序，序列比对确定其为DsMV。

检测结果显示，湖北不同地区样品的DsMV检出率为21.1%～42.9%，其中来自湖北蔡甸2个种植园的17份样品的DsMV检出率相对较高，为30.0%～42.9%；来自山东临沂的3份随机收集样品中未检测到该病毒，所有
样品总检出率为24.7%（表2）。

调查中发现，芋病毒病从北到南发生逐步加重，水芋比旱芋发病重，可能与气候、品种的抗性、栽培方式、生长环境等有关。

北方以旱芋种植为主，因气候寒冷干燥，不利于病毒的增殖，故病毒病为害发生较轻；因水芋产量较旱芋高，南方以水芋种植为主，南方气候温暖湿润，利于病毒的增殖和传播，加上水芋栽培中传统的大水大肥的管理模式导致水芋病毒病发生严重。

本研究中，与芋植株病毒病显症率相比，DsMV的检出率明显偏低，且低于前人
的报道[6]，而且DsMV的检出结果和样品显症情况无明显相关性，有些显症明显的样品未检出DsMV，而有些检出DsMV的样品无明显病毒病症状，这与前人研
究结果一致[8]。

造成此结果的原因可能有以下几种：芋病毒病原存在着混合侵染
现象，造成芋病毒病症状的病原可能有多种，而本研究只检测了分布最广、为害最大的DsMV，其他表现病毒病症状但未检出DsMV的样品可能是其他病原侵染所致。

而且据前人报道[9]，DsMV也存在着较高的分子多样性，可能存在着多种株系，而本研究所用的RT-PCR技术较高的特异性可能也导致了DsMV较低的检出率。

另外，DsMV侵染芋植株的显症机理尚不清楚，有待进一步研究。

【相关文献】
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[2]Zettler F W,Hartman R D.Dasheen somaic virus as a pathogen of cultivated aroids and control of the virus by tissue culture[J].Plant Disease,1987,71(11):958-963.
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[6]李永伟.天南星科植物病毒研究[D].杭州：浙江大学，2002.
[7]陈集双.天南星科植物病毒的分子诊断和半夏研究[M].杭州：浙江大学出版社，2006.
[8]陈集双，李德堡.我国13种天南星科作物上的芋花叶病毒[J].微生物学报，1996，36（2）：126-131.
[9]Pappu S S,Pappu H R,Rybicki E P,et al.Unusual aminoterminal sequence repeat characterizes the capsid protein of dasheen mosaic potyvirus[J].Journal of General Virology, 1994,75:239-242.。