菌种的复苏传代及保存标准程序(新)
菌种的复苏、传代管理规程
目的：建立菌种的复苏、传代管理规程，保证检验人员操作规范化、标准化。
范围：菌种的复苏、传代。
责任人：QC科化验员。
内容：
1 菌种的复苏
1.1 准备好冷冻菌种安瓿、灭菌的毛细滴管、培养皿、镊子、注射器、普通肉汤培养基、灭菌水及普通琼脂斜面，移入接种室（或超净工作台）。
1.2 在接种室（或超净台）按无菌操作要求操作。
1.3 用75%酒精棉擦净菌种安瓿外壁放在无菌培养皿内稍干。
1.4 点燃煤气灯或酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼红热，用毛细管吸取灭菌水少许在灼热处，使其骤冷而炸裂。
1.5 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取0.3ml肉汤培养基加入安瓿内，并摇动使冷冻块溶解，摇匀，用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支肉汤培养基、2支普通琼脂斜面培养基。
1.6 将接种后肉汤培养基及普通琼脂斜面培养基于35～37℃恒温培养12～24h。
1.7 取出培养物，仔细观察菌苔形态，有无杂菌，并转接3支普通琼脂斜面，于35～37℃恒温培养12～24h，供菌种保存与传代用，同时作平板分离单个菌落及涂片镜检，应为典型的菌型。
2 工作用菌种保存与传代
2.1 将上述斜面培养物作为日常工作中使用的菌种，置于冰箱保存。
每月用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物代替原有的菌种，作为工作用菌种。
2.2 工作用菌种，每半年在琼脂平板上分离单个菌落1次，选典型的菌落接种于普通琼脂斜面上，可以代替原有的工作用菌种。
2.3 培养好的斜面，应仔细观察有无杂菌，可涂片镜检，或再移植斜面于35～37℃培养48h检查有无杂菌，有可疑即应废弃，重新取原始冷冻安瓿接种。
菌种的复苏传代及保存标准程序之欧阳地创编
菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
205菌种复苏、传代、保存、使用、销毁标准操作规程
1 目的规范微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2 适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3 术语3.1 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
3.2 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
3.3 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
3.4 菌种的传代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4 职责4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。
4.2 微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5内容5.1冻干菌种的复苏菌种复苏、接种在超净工作台内按无菌操作要求进行。
准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后首先置室温30分钟）、灭菌的毛细滴管、培养皿、镊子、1ml注射器（配有长针头）、营养肉汤培养基、灭菌水及琼脂斜面，将以上物品移入菌种室，用75%乙醇棉球擦净安瓿管外壁放在无菌培养皿内晾干，点燃酒精灯，将安瓿管的封口一端在火焰烧灼红热，用毛细管吸取灭菌水少许滴在灼热处，使其骤冷而炸裂。
在不离开火焰圈内，迅速用1ml注射器抽取0.3ml肉汤培养基加入安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。
用注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种至1支肉汤培养基、2支琼脂斜面培养基。
将接种后的肉汤及培养基斜面根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，用无菌接种环蘸取少许肉汤培养物，然后在平皿接种处进行划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24小时，进行革兰染色镜检及相应的生化试验或采用细菌鉴定条对其进行确认。
如不符合要求，应及时与生产商联系。
5.2菌种传代5.2.1准备准备需用的培养基斜面，在培养基管上贴注牢固的标签，标签上注明菌名及接种日期。
菌种复活、传代、保藏、销毁操作规程
4.6.3灭菌后，再进行清洗和处理。
4.6.4销毁的菌种应做好记录。销毁时由化验负责人监督销毁，保管人员负责销毁。
5.相关记录
无
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4.2菌种确认
用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板（营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂）上或相应的细菌鉴别平板（如伊红亚甲蓝、麦康凯、十六烷基三甲胺、甘露醇高盐）上划线分离单个菌落，置适宜条件下培养（若该类微生物为厌氧菌，则培养条件应为厌氧条件）。以同样方法取真菌和酵母菌至SDA（萨布罗培养基）平板上或玫瑰红钠培养基平板上，23～28℃下培养7d；培养后观察是否具有典型的菌落状态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态以确定菌种。
4.4.9应记好传代记录。
4.5菌种的保藏
4.5.1将试管斜面菌种放入冰箱中4～6℃冷藏保存。
4.5.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中4～6℃保存。
每支保存菌种需标明菌名、标准编号、传次、传代日期。
4.6菌种的销毁
4.6.1菌种使用后或超过贮存期的应进行销毁。
4.6.2需销毁的菌种，应用高压蒸汽（121℃）灭菌20分钟。
4.3污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯。要将该污染培养物做灭菌处理，寻找原因，重新分离挑选纯菌落。
菌种复苏传代保存操作规程
菌种复苏传代保存操作规程菌种复苏传代保存是微生物实验室中常见的操作之一，其目的是将冷冻保存的菌种从冷冻状态中恢复出来，并按照一定的方法传代保存。
以下是菌种复苏传代保存操作规程，共1200字。
一、实验准备1.1 准备所需物资：包括菌种冻存试管、培养基、称量仪器、吸管、移液器、贴标纸等。
1.2 检查完整的实验设备：包括洁净台、离心机、培养箱、移液枪等，确保设备无损坏。
1.3 检查所需培养基的质量：检查培养基的配制日期、有效期等，确保培养基适用于所需菌种。
二、复苏菌种2.1 取出含菌种的冻存试管：从冷冻保存箱中取出所需菌种的冻存试管，并将试管放置于洁净台上。
2.2 快速复苏：将冻存试管置于培养基底部，用力旋转数次，使菌种快速复苏。
2.3 开孔放气：用火焰消毒后的吸管尖端取出菌种后将其放入含菌种的冻存试管中，并迅速封闭试管口，以防菌种污染。
2.4 培养基选择：根据菌种类型的不同，选择相应的培养基进行培养。
如需选择无菌培养基时，需要在使用前先进行灭菌处理。
2.5 培养条件：将含菌种的试管放入预先灭菌处理过的培养基中，确保培养基将菌种完全覆盖，并在适当的培养条件下培养，包括温度、湿度、光照等。
三、传代保存3.1 菌种鉴定与纯化：复苏后的菌种应进行鉴定与纯化，以确保菌种的纯度和正确性。
3.2 菌种传代：将复苏后的菌种接种到新的培养基中，进行传代培养。
传代时应注意传代次数，一般不超过10次。
3.3 传代培养条件：传代时应保持相同的培养条件，以保证菌种的生长状态和性状的稳定。
3.4 保存方式选择：根据菌种的特性和实验需求，选择适当的保存方式，包括持续传代培养、冷冻保存、冷冻干燥等。
3.5 标识和记录：每次传代后，应及时贴标记于保存容器上，并记录传代时间、次数和相关信息，以便后续使用和管理。
四、实验安全与废弃物处理4.1 实验环境安全：在进行菌种复苏传代保存操作时，应注意实验室的环境安全，保持实验室干净、整洁，并严格遵守实验室操作规范。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
菌种复苏传代操作规程
菌种复苏传代操作规程一、背景介绍菌种复苏传代操作是微生物实验室中常见的实验操作之一。
通过复苏并传代菌种，能够恢复其活性并扩大其数量，为后续的实验研究提供足够的菌种量。
本文将对菌种复苏传代操作进行详细的介绍和规程。
二、菌种复苏1.准备工作–检查实验室条件：确保工作台面、培养箱和工具的清洁程度，防止交叉污染。
–准备所需培养基：根据菌种类型选择合适的培养基，如琼脂培养基、液体培养基等，并按照要求配制。
–检查试剂：检查培养基和其他试剂的质量和保存情况，确保使用的试剂没有变质。
–备注标签：为每个培养皿或试管添加标签，标明菌种名称、菌株编号和日期等信息。
2.菌种复苏步骤–从冷冻细胞库中选择合适的冻存物：确保选择与实验目的一致的菌种冻存物进行复苏。
–快速复苏：将冻存物迅速取出，放在含有适量温和培养基的试管中，轻轻摇匀。
–孵育：将试管置于适当的温度和湿度条件下，进行孵育。
通常温度为30°C，孵育时间根据菌种不同而异，一般为24-48小时。
–观察生长情况：观察菌种的生长情况，包括菌落数量和形态特征等。
确认菌种是否成功复苏。
三、菌种传代1.准备工作–准备培养基和试剂：根据菌种特性选择合适的培养基，并按照要求配制好。
–准备培养皿或试管：确保培养皿或试管干净，不含任何污染。
–注射器和接种环的消毒：使用75%乙醇对注射器和接种环进行消毒处理，避免交叉感染。
2.菌种传代步骤–挑取菌落：使用消毒过的注射器，挑取菌落，并迅速划线于新的培养皿或试管中。
–均匀接种：使用消毒过的接种环，将菌落均匀划线于培养皿或试管表面。
–孵育：培养皿或试管置于适当的温湿度条件下，进行孵育。
温度和孵育时间根据菌种特性而异，需根据实验需求进行调整。
–观察生长情况：观察菌种的生长情况，如菌落数量、形态特征和菌落色泽等。
四、菌种传代操作注意事项1.严格消毒–操作前要进行充分的手部卫生和工作台面的消毒。
–使用消毒过的工具，如注射器、接种环等，避免交叉感染。
菌种的传代 保藏 复壮
借用一下标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
205菌种复苏、传代、保存、使用、销毁标准操作规程
1 目的规范微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2 适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3 术语3.1 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
3.2 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
3.3 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
3.4 菌种的传代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4 职责4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。
4.2 微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5内容5.1冻干菌种的复苏菌种复苏、接种在超净工作台内按无菌操作要求进行。
准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后首先置室温30分钟）、灭菌的毛细滴管、培养皿、镊子、1ml注射器（配有长针头）、营养肉汤培养基、灭菌水及琼脂斜面，将以上物品移入菌种室，用75%乙醇棉球擦净安瓿管外壁放在无菌培养皿内晾干，点燃酒精灯，将安瓿管的封口一端在火焰烧灼红热，用毛细管吸取灭菌水少许滴在灼热处，使其骤冷而炸裂。
在不离开火焰圈内，迅速用1ml注射器抽取0.3ml肉汤培养基加入安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。
用注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种至1支肉汤培养基、2支琼脂斜面培养基。
将接种后的肉汤及培养基斜面根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，用无菌接种环蘸取少许肉汤培养物，然后在平皿接种处进行划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24小时，进行革兰染色镜检及相应的生化试验或采用细菌鉴定条对其进行确认。
如不符合要求，应及时与生产商联系。
5.2菌种传代5.2.1准备准备需用的培养基斜面，在培养基管上贴注牢固的标签，标签上注明菌名及接种日期。
菌种的复苏传代及保存标准程序资料
菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
菌种的复苏传代及保存标准程序
菌种得复苏传代及保存标准程序目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。
内容:菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。
１.菌种得复苏1.1冻干菌种得复苏检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1．１.１准备:①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。
③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。
1.１。
2操作:1。
1。
２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、1.1.2。
2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。
1.1。
2。
3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。
１．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1．1。
2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1。
2。
6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。
１。
1.2。
7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。
１、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。
菌种保存、传代、使用、销毁管理及操作规程【最新版】
菌种保存、传代、使用、销毁管理及操作规程菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4、职责部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5、规程菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划(包括临时检验需要)，填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌株)或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4~8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
菌种的保存工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4~8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌:每个月转种一次;酵母菌及芽胞:3~6个月转种一次;丝状真菌每年转种一次。
菌种复苏传代操作规程
菌种复苏传代操作规程一、引言菌种复苏传代操作规程是生物实验室中非常重要的一项工作，它关系到实验的可靠性和成功率。
本文将详细介绍菌种复苏传代操作规程，包括前期准备、菌液制备、培养基制备、菌种接种、传代等步骤。
二、前期准备1.准备好所需设备：无菌培养箱、移液器、显微镜等；2.准备好所需试剂：琼脂、葡萄糖等；3.清洗设备并消毒。
三、菌液制备1.从冰箱中取出需要复苏的菌株，将其在无菌条件下解冻；2.取出一定量的琼脂加入到试管中，并加入适量的葡萄糖和其他所需成分；3.将琼脂溶液加热至沸腾，然后冷却至50℃左右；4.将解冻后的菌株用移液器吸取适量细胞悬浮液，并滴入琼脂溶液中；5.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；6.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
四、培养基制备1.准备好所需试剂：琼脂、葡萄糖等；2.将琼脂加入到试管中，并加入适量的葡萄糖和其他所需成分；3.将琼脂溶液加热至沸腾，然后冷却至50℃左右；4.将制备好的菌液接种到琼脂溶液中，并轻轻摇晃使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
五、菌种接种1.准备好所需设备：无菌移液器、显微镜等；2.从前一代培养基中取出需要传代的菌株；3.用移液器吸取一定量的细胞悬浮液，并滴入新的培养基中；4.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
六、传代1.在前一代培养基中进行培养，当菌落数量达到一定程度时，即可进行传代；2.从前一代培养基中取出需要传代的菌株；3.用移液器吸取一定量的细胞悬浮液，并滴入新的培养基中；4.轻轻摇晃试管使得细胞均匀分布在琼脂中；5.将试管放置于无菌培养箱中，在适当的温度下进行培养。
七、结论通过以上步骤，我们可以成功地进行菌种复苏传代操作。
在实验过程中，我们需要注意保持无菌条件，并严格按照操作规程进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
SOP-QM-8190-03菌种传代、保存、使用、销毁标准操作规程
S O P-Q M-8190-03菌种传代、保存、使用、销毁标准操作规程(共7页)-本页仅作为预览文档封面，使用时请删除本页-山东鲁西药业有限公司GMP文件题目菌种传代、保存、使用、销毁标准操作规程新订修订√文件编码编制部门质量部制定人审核人批准人制定日期年月日审核日期年月日批准日期年月日颁发部门QA办生效日期年月日分发部门质量部目的：建立检定用菌种的管理制度，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
责任：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发；微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
1、定义：标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
2、规程：检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）或传代用菌种，菌种购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
检定菌的接收菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4-8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
检定菌的保存工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
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菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。
②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。
1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。
1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。
标明菌名、编号及冻存日期等。
置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。
1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。
1.3冻存菌悬液的复苏：1.3.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。
③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.3.2操作：1.3.2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。
1.3.2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。
1.3.2.3用75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。
1.3.2.4点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至10ml液体培养基中（生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中）。
或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。
1.3.2.5将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。
1.3.2.6将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在30~35℃恒温培养18-24小时，真菌在23~28℃恒温培养24-48小时，黑曲霉*培养5~7天）。
1.3.2.7仔细观察培养物：如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置2~8℃冰箱内保存；如发现菌苔形状不典型，可进行平板分离单菌落。
1.3.2.8注意：已解冻的冻存管不可再冻存。
2.菌种的接种、传代2.1.准备①用具：接种环、酒精灯。
②培养基：营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。
培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。
③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。
④菌种：根据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超过4代。
2.2将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。
2.3点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，两试管口平齐靠近火焰旁。
2.4用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。
2.5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。
2.6将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。
2.7取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。
2.8已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；真菌管一般置23~28℃培养24~48小时（黑曲霉需培养5~7天）。
2.9培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。
必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。
如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。
2.10检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃保存，一般1个月转种一次。
2.11菌种（第n 代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。
注意：黑曲霉*致病性很强，操作时应特别注意：①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操作的风险性。
②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。
③若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。
④接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。
⑤接种传代后，使用过的器具均需在121℃，30分钟高压灭菌后再作处理。
3.菌种的保存：3.1菌悬液冻存法：冻干菌种（0代）复苏后，可按上述方法制备第1代菌悬液、第2代菌悬液进行冻存。
3.2琼脂斜面低温保存法：日常使用的工作用菌种可用此法在短期内保存。
3.2.1将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。
放在4℃左右的冰箱中保藏。
每隔 1个月移种一次，继续进行保藏。
3.2.2适用范围：细菌、酵母菌、真菌保藏。
3.2.4注意事项：①保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。
②保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。
③必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。
④每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。
⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保存。
3.3液体石蜡保存法：利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。
3.3.1方法：3.3.1.1将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。
3.3.1.2取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。
3.3.1.3将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。
3.3.2适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。
3.3.3注意事项：①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。
②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。
③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。
④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。
⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。
一般以高出斜面1 ㎝为宜。
⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。
4.菌种在传代、保存或使用过程中发现污染、变异，应及时销毁，不得用于常规检验。
5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录：《0代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。
6.菌种按“检定菌管理制度”管理。
7.附录：7.1菌种编号：传代复苏的菌种应有统一编号,编号方法为:菌种代号-G或W-代次-管号。
G表示用于冻存的菌种，W表示工作用菌种。
①菌种代号：常用菌种的代号见下表：②菌种购进的年、月：如0608表示2006年8月购进③菌种代次，用1、2、3、4、5表示。
④母代冻存菌种的编号，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…表示。
⑤菌种的序号，用1、2、3…表示。
7.2常用工作用菌种的生物学特征①金黄色葡萄球菌形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄状，菌落直径为0.8～1.5mm，革兰氏染色阳性。
培养特性：⑴在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中，生长良好。
在28～38℃生长较好，pH为4.5～9.8，以pH7.4左右最好。
⑵营养琼脂平板，培养24～48小时，形成圆形凸出、边缘整齐、表面光泽且金黄色的菌落，直径1～2mm（应挑选光滑型菌落）。