不同浓度分离胶与浓缩胶的配制
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
分离胶浓缩胶配置
2.6 5.37.910.613.2123451.3 2.5 3.85 6.30.050.10.150.20.250.050.10.150.20.250.0040.0080.0120.0160.022.34.6 6.99.311.51.3 2.745.36.71.3 2.5 3.85 6.30.050.10.150.20.250.050.10.150.20.250.0030.0060.0090.0120.0151.94 5.97.99.91.7 3.35 6.78.31.3 2.5 3.85 6.30.050.10.150.20.250.050.10.150.20.250.0020.0040.0060.0080.011.6 3.3 4.9 6.68.22468101.3 2.5 3.85 6.30.050.10.150.20.250.050.10.150.20.250.0020.0040.0060.0080.011.1 2.3 3.4 4.6 5.72.557.51012.51.3 2.5 3.85 6.30.050.10.150.20.250.050.10.150.20.250.0020.0040.0060.0080.01各种组分名称ComponentsTEMED5% stacking gels for denaturing SDS-PAGEVolume of components(ml)per gel molH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵30%Acrylamide1.5M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵TEMED15%Gel10%SDS 10%过硫酸铵TEMED12%GelH2OTEMED10%GelH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCL(pH8.8)H2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵30%Acrylamide1.5M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵TEMED8%Gel分离胶10ml/块 浓缩胶3ml/块 marker 7ul 样品30ul各种凝胶体积所对应的各种组份的5ml 10ml 15ml 20ml 25ml6%GelH2O0.68 1.4 2.1 2.7 3.40.170.330.50.670.830.130.250.380.50.630.010.020.030.040.050.010.020.030.040.050.0010.0020.0030.0040.005适宜凝胶浓度246812341.9 3.8 5.77.60.050.10.150.20.050.10.150.20.0040.0080.0120.0161.7 3.35 6.71.3 2.74 5.31.9 3.8 5.77.60.050.10.150.20.050.10.150.20.0030.0060.0090.0121.3 2.74 5.31.7 3.35 6.71.9 3.8 5.77.60.050.10.150.20.050.10.150.20.0020.0040.0060.008123424681.9 3.8 5.77.60.050.10.150.20.050.10.150.20.0020.0040.0060.008Components碧云天各种组分名称H2O30%Acrylamide1M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵TEMED1M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵TEMED12%Gel10%过硫酸铵TEMED10%GelH2O30%Acrylamide8%GelH2O30%Acrylamide1M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS H2O30%Acrylamide1M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS 10%过硫酸铵TEMED10-40各种凝胶体积所对应的各种组份的5ml 10ml 15ml 20ml6%Gel10到3012%20-80＜1015%12-60＞1008%50-15030-10010%30-901.5M Tris(pH6.8)10%SDS 10% ammonium persuifate TEMED Protein(KD)碧云天Protein(KD)1ml 2ml 3ml 4ml 5mlH2030%acryl-bisacrylamide mix0.51 1.522.557.5101.9 3.8 5.77.60.050.10.150.20.050.10.150.20.0020.0040.0060.0081.42.1 2.70.330.50.670.250.380.50.020.030.040.020.030.040.0020.0030.004CapG 38KDCapG-EGFP 67KD 故分离胶应选10%，我做的第一次选用了15%GapDH 36KD30%acryl-bisacrylamide mix 1M Tris(pH6.8)10%SDS 10% ammonium persuifate TEMED Components10%过硫酸铵TEMED碧云天5% stacking gels for denaturing SVolume of components(ml)pe1ml 2ml 3ml 4mlH2015%GelH2O30%Acrylamide1M Tris-HCL(pH8.8)10%SDS组份的取样量30ml 40ml 50ml15.921.226.568107.51012.50.30.40.50.30.40.50.0240.0320.0413.918.523.2810.713.37.51012.50.30.40.50.30.40.50.0180.0240.0311.915.919.81013.316.77.51012.50.30.40.50.30.40.50.0120.0160.029.913.216.51216207.51012.50.30.40.50.30.40.50.0120.0160.026.99.211.51520257.51012.50.30.40.50.30.40.50.0120.0160.02 l mold volume of6ml 8ml 10ml4.15.56.81 1.3 1.70.751 1.250.060.080.10.060.080.10.0060.0080.01适宜凝胶浓度6%8%10%12%15%组份的取样量30ml 50ml122061011.4190.30.50.30.50.0240.041016.7813.311.4190.30.50.30.50.0180.03813.31016.711.4190.30.50.30.50.0120.02610122011.4190.30.50.30.50.0120.0235152511.4190.30.50.30.50.0120.02ing SDS-PAGEml)per gel mold volume of5ml 6ml 8ml 10ml4.15.56.81 1.3 1.70.751 1.250.060.080.10.060.080.10.0060.0080.01。
SDS-PAGE电泳实验流程
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
⏹1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
⏹2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
⏹3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr =K―bmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂⏹仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
⏹原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
⏹试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方
SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。
CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。
1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。
1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质， 应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。
本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。
【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。
电泳条件及不同胶浓度配制
试剂配制：（1）30%聚丙烯酰胺贮液：将聚丙烯酰胺（电泳级）150g，N,N′—甲叉双丙烯酰胺（电泳级）4g溶剂于400ml双蒸水中，补充双蒸水至500ml，滤纸过滤后，于棕色瓶中4℃避光保存。
（2）1.5mol/l Tris碱（pH8.8）：将90.75Tris碱溶解于400ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH8.8，补充双蒸水定容至500ml，4℃冰箱保存。
（3）1.0mol/l Tris碱（pH6.8）：将12.1Tris碱溶解于80ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH6.8，补充双蒸水定容至100ml，4℃冰箱保存。
（4）10%SDS：将10gSDS溶剂于100ml双蒸水中，混匀后，室温保存。
（5）10%过硫酸铵：将0.1过硫酸铵（电泳级）溶解于1ml双蒸水中（用时加水溶解），4℃冰箱保存。
（6）10倍电泳缓冲液（25mmolTris,192mmol甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）：在10L大玻璃管中加8L双蒸水，303gTris碱，1442g甘氨酸，100gSDS溶解后调pH8.3补水至10L，混匀后，室温保存。
（7）样品缓冲液：将1.6ml10%SDS，0.8ml甘油，1.0ml1.0mol/l Tris（pH6.8），加入到4.0ml 双蒸水中，加0.01%溴酚蓝，0.4ml巯基乙醇。
（8）染色液配制0.25%考马斯亮蓝（CCB）染色液：考马斯亮蓝R-250甲醇-醋酸混合液。
取1.25g考马斯亮蓝R-250，溶于227ml蒸馏水中，加甲醇227ml，再加入冰乙酸46ml（近似5:5:1）搅拌使其充分溶解，室温保存备用。
（9）脱色液配制：甲醇：水：醋酸=5:5:1混合备用。
或用20%乙醇水溶液。
实验步骤1待测蛋白样品制备（1）根据每种方法提取的蛋白，用含SDS的样品缓冲溶液溶解，充分溶解后沸水加入3-5min，1600r/min离心5min，取3上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理
SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
(完整版)SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方
SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。
CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。
1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。
1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
【2017年整理】植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定
《生物化学》实验五植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定学生：吴潇潇学号：0812134 指导老师：张芬琴（河西学院生命科学与工程系 08（1）班甘肃张掖 734000）摘要：以三叶草和草坪草的叶片为材料，分别采用丙二醛法、考马斯蓝法及酶活力测定的方法对三叶草及草坪草叶片内丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力进行对比测定。
实验结果表明：草坪草内丙二醛含量高于三叶草的，且都在532nm处吸光值最大；三叶草叶片内蛋白质含量高于草坪草叶片的；三叶草叶片中过氧化物酶活力大于草坪草叶片的。
关键词：三叶草草坪草丙二醛含量蛋白质含量过氧化物酶活力对比引言：丙二醛 (MDA)，无色针状晶体，熔点72～74℃，一般含两个结晶水，60℃下真空干燥可得无水物，易潮解，纯的丙二醛在中性条件下稳定，但在酸性条件下不稳定。
由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得，可在高真空下升华精制，主要用于医药中间体、感光色素的原料。
与蛋白质不相容，有潜在的致癌性。
生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。
蛋白质（protein）由C、H、O、N组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe、Zn、Cu、B、Mn、I等。
人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，都是由20种标准氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新并时刻处于动态平衡中。
酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
sds-page中浓缩胶和分离胶工作原理
sds-page中浓缩胶和分离胶工作原理SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用于蛋白质分离和定量的方法。
它通过将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳来实现蛋白质分离。
SDS-PAGE中的关键步骤包括制备胶液、制备样品和运行凝胶电泳。
其中，浓缩胶和分离胶是SDS-PAGE中的两个关键组分，下面将分别详细介绍它们的工作原理。
浓缩胶是SDS-PAGE中的第一个凝胶。
其主要作用是将样品中的蛋白质浓缩在一个较小的体积中，从而提高蛋白质的负载量。
浓缩胶通常是由较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶制成。
制备浓缩胶的步骤如下：1.根据需要的凝胶浓度和厚度，将适量的丙烯酰胺和交联剂加入缓冲液中，得到聚合物化合物。
2.将聚合物化合物倒入凝胶模具中，加入推荐量的TEMED和过硫酸铵（APS），使聚合反应开始。
3.反应后，将浓缩胶从模具中取出，并用缓冲液冲洗浓缩胶，以去除未反应的物质。
浓缩胶的工作原理是通过聚合物网状结构的形成，将蛋白质限制在凝胶中。
聚合物中包含交联剂，能够在聚丙烯酰胺分子之间产生交联反应，形成一个三维的网状结构。
蛋白质样品中的SDS（十二烷基硫酸钠）和化学试剂在电泳过程中会与聚合物发生作用，使蛋白质分子展开并与聚合物的分子结合。
这样，蛋白质就被限制在凝胶内部，无法自由迁移。
分离胶是SDS-PAGE中的第二个凝胶，也是用来实现蛋白质分离的关键步骤。
分离胶的主要作用是根据蛋白质的大小和电荷特性，将蛋白质样品分离成不同的带状条纹。
分离胶通常是由较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶制成。
制备分离胶的步骤如下：1.根据需要的凝胶浓度和厚度，将适量的丙烯酰胺和交联剂加入缓冲液中，得到聚合物化合物。
2.将聚合物化合物倒入凝胶模具中，加入推荐量的TEMED和过硫酸铵（APS），使聚合反应开始。
3.反应后，将分离胶从模具中取出，并用缓冲液冲洗分离胶，以去除未反应的物质。
分离胶的工作原理是通过改变凝胶的孔隙结构来实现蛋白质的分离。
在分离胶中，聚丙烯酰胺凝胶网状结构相对较松散，有更多的孔隙。
wb分离胶比例
wb分离胶比例
在进行WB实验时，分离胶的选择需要根据目的蛋白的分子量大小来决定。
常用的分离胶浓度有6%、8%、10%、12%，分子量越大，所用的胶浓度越低，蛋白电泳速度越快。
例如，测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。
在Western Blot（WB）实验中，SDS-PAGE分离胶通常根据分子量范围的需求来选择不同的浓度。
以下是配制不同浓度SDS-PAGE分离胶的一般比例示例：
以6%的SDS-PAGE分离胶为例（基于提供的信息片段）：
- 凝胶体积为5毫升时：
- 蒸馏水：2.6毫升
- 30%Acr-Bis（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合液，一般比例是29:1）：1毫升
- 4×Tris-HCl-SDS分离胶缓冲液（pH 8.8）：2.4毫升
- 10%过硫酸铵（APS）：适量（催化聚合反应，用量通常是总量的0.1%）
- TEMED（四甲基乙二胺）：几滴（加速凝胶聚合）
若要配制其他浓度如10%或12%的SDS-PAGE分离胶，则需要相应调整30%Acr-Bis母液的使用量，同时保持蒸馏水和缓冲液的比例随着总胶液体积的变化而变化。
对于更精确的配比，请参照具体的实验手册或者试剂盒说明书，因为实际配方可能会因厂家和实验要求的不同而有所差异。
制胶
1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
2、封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)(二) 样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。