叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定

叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定

刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅

【摘要】为确诊叉尾斗鱼肉瘤病,采集自然患病鱼进行病理学观察,基于淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因采用PCR方法对肉瘤状增生物进行检测和进化树分析.结果显示,患病叉尾斗鱼肉瘤状增生物是由大量囊肿细胞聚集在皮肤和鳍条上形成,鳃、肝、肾、脾、肠等内脏组织器官均未观察到囊肿细胞.囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9～1823.8倍,细胞核不规则,细胞质内可见嗜碱性包涵体;透射电镜观察可见囊

肿细胞胞质内存在大量直径约171.5 nm的病毒粒子.病理观察结果符合鱼类淋巴

囊肿病毒感染的临床特征,PCR方法检测到1272 bp的目的片段,测序结果显示,该

基因与GenBank中的淋巴囊肿病毒K J408271.1序列相似性达99％.试验结果表明,叉尾斗鱼肉瘤病为淋巴囊肿病毒感染所致,皮肤和鳍是病毒感染的靶器官.本研究为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供了试验参考.

【期刊名称】《水产科学》

【年(卷),期】2018(037)005

【总页数】5页(P679-683)

【关键词】叉尾斗鱼;肉瘤病;淋巴囊肿病毒;病理;诊断

【作者】刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅

【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物科技

学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物

医学院,四川成都611130;四川农业大学生命科学学院,四川雅安625014;四川农业大学动物医学院,四川成都611130

【正文语种】中文

【中图分类】S941.1

叉尾斗鱼(Macropodus opercularis)属鲈形目、攀鲈亚目、丝足鲈科，为小型淡水观赏鱼类；其色彩艳丽、体形优美，备受各国观赏鱼爱好者追捧，被誉为“天堂鱼”[1]。叉尾斗鱼肉瘤病是养殖过程中出现的一种慢性皮肤瘤，主要症状为患病鱼的头部、躯干和鳍条聚集出现成串或成团的白色半透明状囊肿物；该病不会导致鱼类大规模死亡，但会严重影响观赏价值。1975年澳大利亚学者最早描述了叉尾斗鱼体表出现的“覆盆子样”增生物，报道指出其具有典型的淋巴囊肿细胞结构[2]。虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus)被认为是鱼类淋巴囊肿病的病原，其可感染全球范围内超过125种硬骨鱼类，引起鱼类浅表组织出现慢性增生性囊肿，疾病给水产养殖业造成巨大经济损失[3]。在我国，养殖鱼类云纹石斑鱼(Epinehelus moara)[4]和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5-6]是淋巴囊肿病毒的易感宿主；2014年Xu等[7]研究证实虹彩病毒科淋巴囊肿病毒也是叉尾斗鱼重要的病原。

2015—2016年四川某观赏鱼店先后多批自广东购进的叉尾斗鱼体表均出现肉瘤状增生物，疑似为淋巴囊肿病毒感染。为确定病原，笔者收集患肉瘤病病鱼，进行了病理学检测和增生物主要衣壳蛋白基因序列分析，为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病叉尾斗鱼体长5～10 cm，8～12月龄，购自广东惠州某斗鱼养殖场；DNA 提取试剂盒购自QIAGEN公司；D2000 Marker和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病理学观察

采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉患病鱼致死，体表病变观察并剖检，记录病理变化并拍照。

1.3 组织病理学观察

采集皮肤、鳃、心、肝、脾、肾、脑和肠组织，室温固定于4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色，光学显微镜观察增生物形态和组织病理变化，并拍照，Image-Pro Plus 6.0用于细胞大小测定。

1.4 组织透射电镜观察

取皮肤体表肉瘤状增生物，固定于2.5%戊二醛，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀—枸橼酸铅双染色透射电镜观察病毒形态，并拍照。

1.5 淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因检测

以肉瘤样增生组织中的基因组DNA为模板，利用淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因引物MCP-F(5′-ATGACTTCTGTAGCGGGTTCAAGTG-3′)和MCP-R(5′-CTAAAGTACAGGAAATCCCATTGAAC-3′)进行PCR扩增[7]。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 2 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段送上海生物工程有限公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLSAT比对分析，采用Mega 4.1构建进化树。

2 结果

2.1 病变观察

体表肉瘤状增生物呈白色或灰白色，半透明球形小颗粒状，单个成片或堆积成团，

集中分布在患病鱼的背鳍、臀鳍、尾鳍及鳍条基部区域(图1a)。增生物早期主要

散布于鳍条上，逐渐增多堆积成团伴有鳍条充血(图1b)，严重时出现蛀鳍，增生

物成片扩散蔓延至体表，鱼体体色明显变淡(图1c)。解剖观察，鳃丝轻微肿胀，

内脏未见明显异常。

2.2 组织病理观察

体表肉瘤状增生物是由大量直径约48.7～217.8 μm(n=11)的囊肿细胞聚集形成。皮肤上大小不等的球形囊肿细胞相互挤压堆积出现在真皮层，囊肿细胞间有大量浸润的炎性细胞和增生的上皮细胞，真皮层中黑素细胞聚集减少，而皮下肌肉组织结构清晰、肌细胞排列整齐无明显病变(图2a)。鳃丝肿胀增厚，鳃小片呼吸上皮浮离，基底黏液细胞增多，炎性细胞浸润(图2b)。脾脏出血，白髓区域减小(图2c)。其他组织器官无明显病变。

图1 体表病变a.对照(上)，鳍条感染(中)，体表感染(下)；b：鳍条充血；c：蛀鳍. 图2 组织病理变化a.皮肤；b：鳃丝；c：脾脏. E: 表皮；D: 真皮；M: 肌肉；PL:

鳃丝；Epc: 呼吸上皮；Mc: 黏液细胞；Ⅰ:脾脏出血；Ⅱ:白髓减少.

囊肿细胞仅出现在皮肤和鳍条上，在鳃、脾、肠、肝、肾等内脏组织中均未观察到囊肿样异常肥大细胞。正常细胞直径为5.1～6.4 μm，囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9～1823.8倍(按面积计算)。典型的囊肿细胞核深染位于细胞一侧，染色

质成团聚集；细胞质边缘有大量网状嗜碱性包涵体，细胞膜为均质透明细带状(图

3a)；膜外单层毛细血管包裹滋养着感染阶段的囊肿细胞(图3b)，衰老的囊肿细胞缩小，细胞膜均质变厚，破裂，胞内物质降解(图3c)。

2.3 透射电镜观察

体表肉瘤状增生物在透射电镜下可观察到大量形态一致的病毒粒子分布于囊肿细胞胞质内，直径约(171.5±1.2) nm，具有衣壳，切面呈六边形对称结构(图4)。

图3 囊肿细胞的显微结构a.典型囊肿细胞；b：感染阶段细胞；c:降解阶段细胞. N: