氨基酸发酵

第一部分基础练习

一、名词解释

1.末端产物阻遏：是指由某代谢途径末端产物的过量累积时而引起的反馈阻遏，是一种较为重要的反馈阻遏。

2.分解代谢物阻遏：是指细胞内同时存在两种碳源(或两种氮源)时，利用快的那种碳源(或氮源)会阻遏利用慢的那种碳源(或氮源)的有关酶合成的现象。

3.代谢调控:在发酵工业中，为了大量积累人们所需要的某一代谢产物，常人为地打破微生物细胞内的自动代谢调节机制，使代谢朝人们所希望的方向进行，这就是所谓的代谢调控。

4.营养缺陷型菌株因基因突变致使某一合成途径中断，丧失合成其生长中必需的某种物质的能力，使末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈抑制或调节，可使代谢途径中的某一中间产物过量积累，也可使分子代谢的中间产物和另一分支途径中的末端产物积累。

5.外源诱导物：抗生素生物合成过程中，参与次级代谢的酶，有些是诱导酶，诱导物有的是外界加入的，称外源诱导物。

二、问答题

1.答：氨基酸生产方法主要有合成法与发酵法两种。

2.答：野生型菌株，营养缺陷型突变株，或是氨基酸结构类似物抗性突变株.

3.答：氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分枝点处的优先合成，除此之外，还有一些特殊的调节机制，如协同反馈抑制、合作（或增效）反馈抑制、同功酶控制、顺序控制、平衡合成、代谢互锁等。

4.答：在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸合成分支上的第一个酶——二氢吡啶合成酶（DDP合成酶）受到与本途径无关的另一种氨基酸——亮氨酸的阻遏（即代谢互锁）。

5.答：具有分子代谢途径的分支点。即在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底物，由于两种酶对底物的Km值（即对底物的亲和力）不同，故

两条支路的一条优先合成。

第二部分技能训练

一、选择题

1.D

2.C

3.D

4.B

5.B

6.A

7.C

二、问答题

1.（1）磷酸盐磷酸盐浓度对氨基酸发酵的影响很大。例如谷氨酸发酵中，磷酸盐浓度高时，抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性，菌体生长较好，但谷氨酸产量低，代谢向合成缬氨酸转化；磷酸盐不足时，糖代谢受抑制，糖耗慢。

（2）镁镁离子是己糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶等的激活剂，并能促进葡萄糖-6－磷酸脱氢酶的活力。镁含量太少会影响碳源的氧化。一般G＋菌要求镁离子浓度最低为25ppm，G－菌为4～6ppm。

（3）钾钾离子是许多酶的激活剂，能促进糖代谢。氨基酸发酵需要钾的量受菌种性质、培养条件和发酵阶段等条件影响，例如谷氨酸发酵时，钾盐多时有利于产酸，钾盐少时有利于菌体生长。

（4）其他无机盐氨基酸发酵所需要的元素还有硫、钠、锰、铁等。硫是细胞中含硫氨基酸的组成成分，也是构成某些活性物质如辅酶A和谷胱甘肽等的成分。培养基中的硫可通过加入的MgSO4·7H2O引入，不必另加。钠起调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入的钠已足够，也不必另加。锰是许多酶的激活剂，一般培养基中使用MnSO4·4H2O 2ppm已足够。铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成成分，大量铁离子可促进谷氨酸产生菌的生长。但是铜离子对氨基酸发酵有明显的毒害作用，培养基中含0.001％硫酸铜时，谷氨酸产率明显下降，当铜离子达到0.1％时菌体停止生长。

2.利用营养缺陷型菌种，并及时分离产物。

3.AK（天冬氨酸激酶）受末端产物苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制，这种抑制在苏氨酸或赖氨酸单独过量存在时并不会发生。通过遗传手段可获得缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株，但只有在培养基内添加苏氨酸，此突变株才能生长。所以生产中，采用低水平的苏氨酸补充量，帮助天冬氨酸激酶避开反馈抑制作用，使代谢中间产物向赖氨酸支路转移，合成大量的目的产物赖氨酸。

第三部分综合应用

1.总结实际生产中提高发酵产率的主要措施？

答：选育高产菌种，改良菌种性能；改进发酵工艺(例如采用一次高浓度糖发酵；降低发酵糖浓度，连续流加糖发酵；混合碳源发酵；应用电子计算机控制和管理发酵，使发酵工艺最佳化；通电发酵法；固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸)。

2.分析柠檬酸的发酵生产中有哪些人为的代谢调控点？这些具体操作是为了克服代谢途径中的哪些不利因素？

答：柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物,在正常的微生物体内

不能够积累的,如果有积累的话,与柠檬酸合成有关的各种酶的活性,则会受到抑制或阻遏。

（1）磷酸果糖激酶(PFK)活性的调节

从葡萄糖——柠檬酸的合成过程中,PFK是一种调节酶或者称之为关键酶,其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制,这种抑制必须解除,否则,柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断,停止柠檬酸的合成。

研究表明,微生物体内的NH4+,可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用,在较高的NH4+的浓度下,细胞可以大量形成柠檬酸。

进一步的研究表明,柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中,NH4+浓度异常的高,可达到25mmol/L,显然,由于Mn+的缺乏,使得微生物体内NH4+浓度升高,进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用,使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。

当培养基中Mn+缺乏时,NH4+浓度升高,同时微生物体内积累几种氨基酸(GA,GLu,Arg,Oin等),这些氨基酸的积累,意味着体内蛋白质的合成受阻,而外源蛋白质的分解速度则不受到影响,这样NH4+的消耗下降,NH4+浓度就会升高。

（2）顺乌头酸酶活性的控制

该酶的丧失或失活是阻断TCA循环,大量生成柠檬酸的必要条件.通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱,但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响,控制培养基中的Fe2+的浓度,可以使该酶失活。因此,柠檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料,目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中,培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L,原因目前尚没有搞清楚。

（3）增加氧气的浓度

增加氧气的浓度，可以提高柠檬酸的产量。

菌体要大量合成柠檬酸,从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通,在这个过程中,有一步反应:丙酮酸氧化脱羧,每分子丙酮酸可产生一分子的NADH,在有氧的条件下,每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O,并氧化磷酸化产生3分子的ATP,造成了微生物体内能荷的增加,能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性,使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止,怎么能够大量合成柠檬酸呢。如果NADH(还原型)不能够快速的被氧化转变成NAD(氧化型),则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止,仍然不能够合成柠檬酸。而实际