人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较

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人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。

方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。

结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。

结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。

%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

人脐带间充质干细胞体外分离、培养、扩增方法及生物学特性研究

ＡＳＲＣＯｂｅｔｅＴｏｅｔｂｉｈａｍｅｈｄｔｅａａｅｍｅｅｃｙｌｓｅｃｌｒｍｕｎＢＴＡＴ：ｊｃｉｖｓａｌｔｏｏｓｐｒｔｓｓｎｈｍａｔｍｅｌｆｏｈｍａｓ
ｕｍｂｌｃ１ｃｄ（ｉｉａｏｒＵＣ＿ＳＣｓｃｌｕｒＣ＿ＳｎｖｉｒＭ），ｕｔｅＵＭＣｓｉｔｏ，ａｔｙｉｓｉｌｉａｃａａｔｒｓｉｓｎｄｓｕｄｔｂｏｏｇｃ１ｈｒｃｅｉｔｃ．ＭｅｈｄＭＳｒｅａａｅｒｍｔｏｓＣｓｗｅｅｓｐｒｔｄｆｏｈｕｍａｍｂｌｃ１ｃｄｗｉｈｔｎｚｍｅｍｅｈｄａｘｎｎｕｉｉａｏｒｔｗｏｅｙｔｏｎｄｅｐａ — ｄｉｕｔｅｎｖｔｏｎｇｃｌｕｒｄｉｉｒ．Ｇｒｗｔｕｒｅｅｌｒｒｗｎａｕｆｃｎｉｅｒｅｅｔｄｗｉｈｏｈｃｖｓｏｆｃｌｓｗｅｅｄａｎｄｓｒａｅａｔｇｎｓｗｅｅｄｔｃｅｔｆｏｗｙｏｍｅｒ．ｔｍｏｒｇｉｉｉｓｏｆｃｌｓｗｅｅｔｓｅｂｓｆｇｒｃｏｎｔｏｄｌｃｔｔｙｕｉｅｃｔｅｅｌｒｅｔｄｙｏｔａａｌｎｉｇｍｅｈ．ＲｅｕｔＴｈｅｓｌｓｍｅｈｓｏｕｔｅａｄｅｐａｉｎｏｆＵＣ＿ＣｓｉｉｒｒｓａｉｈｅｔｏｄｆｃｌｕｒｎｘｎｓｏＭＳｎｖｔｏｗｅｅｅｔｂｌｓｄ．Ａｄｈｓｖｅｃｌｓｗｅｅａ１ｅｉｅｌｒｌｐｉｉｏＳＣ－ｅａｅａｉｅｓ，ｓｈｓＣＤ２９，ＣＤ１５，ＣＤ４４，ａｄＣＤ１ｏｓｔｖｅｆｒＭｒｌｔｄｎｔｇｎｕｃａ０ｎ３，ｂｎｅｔｖｏｕｔｇａｉｅｆｒＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ３１，ＣＤ１０６，ａＨＬＡ— ｎｄＤＲ．Ｍｕｈｉｃｔｏｎｏｆｅｌｓ０ｐｉａｉｃｌｓｗａ３ｈｏｕｓＣｅ１ｙｌｒ．ｌｃｃｅ

人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究

ｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ．Ｒｅｒｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｌａｔｅｎｔｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｌｏｇａｉｔｒｈｍｉｃｒｏｇｗｔｈｐｈａｓｅｏｆｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎ
ｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｗａｓｄｒａｗｎ．Ｂａｓｅｄｏｎｃｅｌｌｇｒｏｔｈｗｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅ３ｐａｓｓａｇｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｉｓｔｉｃｓｏｆｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｉｍｍｕ —
ＳＣｓ），ａｎｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅａｎｄｕｈｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｐｉｒｍａｒｙ

人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨

殖后，设立４个因素和３个水平，分为９个实验组，分另ｑ观察不同冻存条件下对各组ＨＵＣ－ＭＳＣ的存活率、回收率、免疫抗原ＣＤ３４
和ＣＤ４４的影响。结果第９组ＨＵＣ－ＭＳＣ解冻复苏后，其存活率、回收率以及免疫抗原ＣＤ４４积分值均高于其他组（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），
关键词：间质干细胞；连续传代；细胞培养技术；低温保存；正交试验
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．１２．００３
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７３—４１３０（２０１２）１２—１４１４—０３
ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＬｉＺｈｅｎｇｍｉｎ，ＧｏｎｇＣｕｉｃｕｉ
国际检验医学杂志２０１２年６月第墅鲞箜塑』生！』堡！：塑！ · 基础实验研究论 Nhomakorabea著 ·
人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨
李正民，宫璀璀（中国人民解放军第一五三中心医院检验科，郑州４５００４２）
摘要：目的观察不同冻存条件对人脐带间充质干细胞（ＨＵＣ—ＭＳＣ）冻存效果的影响。方法将ＨＵＣ－ＭＳＣ传代培养增
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｏ．１５３ＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｅｏｐｌｅｓ

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。

4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。

7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。

8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞1 资料与方法1.1 一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4C保存，6h内无菌处理。

1.2 脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's 液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton 胶。

将其剪碎至1mm31织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20〜25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37 C，体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

3〜5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%台牛血清的DMEM/F1培养基，正向放入体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d 可有间充质干细胞爬出。

1.3 脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F1（2 不含酚红）、StemProRMSC SFM 三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

1.4流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1X 106个细胞，分别加入10 u l单克隆抗体CD73 CD34 CD45 CD105 HLA-DRHLA-ABC及阴性对照lgG1 -PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min, PBS洗涤两次，室温300g, 5min。

PBS重悬后上流式细胞仪。

1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4 代细胞，调整细胞浓度至0.2 X 105/ml，加入96孔板。

每孔90卩l放在37C、体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内培养。

7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100卩l换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。

用酶标仪波长450nm测定各孔OD 值。

以OD直代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。

干细胞（MSCs）分离方法

干细胞（MSCs）分离方法目前常用的干细胞分离方法主要有：组织贴壁法、差速离心法、流式分选法、磁珠分选法。

1 组织贴壁法根据MSCs具有在塑料或玻璃培养皿中贴壁生长的特性对其进行分离。

例如：脐带间充质干细胞的分离提取(1) 无菌取剖宫产新鲜脐带约10 cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2～3cm 的小段，再次漂洗，纵行剖开脐带，剔除1 条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。

(2) 用眼科剪将华通胶剪碎成1mm²的小组织块，转移至细胞培养瓶中，加入含有体积分数为10%FBS、100 U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，于5%CO2、37℃的培养箱中静置培养。

(3) 倒置显微镜每天观察细胞生长情况。

(4) 1周后首次换液，此后3～4d 换液1次。

(5) 待细胞长至80%～90%融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代，显微镜下控制消化时间。

2差速离心法主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

适用于人，猴子，犬等物种骨髓间充质干细胞的提取3 流式分选法流式细胞仪分离法原理是：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。

流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。

在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

_三阶段法_分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞

三阶段法分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞张东辉1*,许永华1,许琴1,李建瑛1,是文辉1,李佳佳1,卢开伯1,邢彦超2,于良宽3,龙志新4(1兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物科,2输血科,3妇产科;4新疆出入境检验检疫局,新疆乌鲁木齐830000)摘要:目的探讨运用三阶段法分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞的效果。

方法取人脐带血4份,经过3个阶段(去除红细胞阶段、短暂培养阶段、持续培养阶段),以完全低糖DM EM(含20%胎牛血清)为培养基,纯化分离人脐血间充质干细胞。

传代至第3代通过流式细胞仪和间充质干细胞诱导分化为成骨细胞进行鉴定。

结果4份人脐血中3份分离出间充质干细胞。

分离培养的细胞经流式细胞仪检测不表达造血细胞的抗原(CD34-),表达间充质干细胞的抗原(CD29+、CD44+、CD105+),并能向成骨细胞方向分化。

结论三阶段法能够简便、有效地从人脐血中分离出间充质干细胞。

关键词:人脐静脉血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R446;R34文献标识码:A文章编号:1009 5551(2010)10 1188 03C ulture and identify hu man umbilical cord b lood MSC s using three p hase approachZHANG Don ghui,X U Yong hua,XU Qing,et al(Dep ar tm ant of A nimal E x p eriment,Ur umqi General H osp ital of L anz hou Command,P L A,Urumqi830000,China)Abstract:Obiective To culture and identify human umbilical cord blood MSCs(m esenchy mal stem cells) using three phase approach.Methods Through three phases(remov al ofr ed blo od cell,br iefly culturing and phase of lasting culturing)to separate M SCs from4hum an umbilical co rd bloo d sam ples.Culture me dium w ith low g lucose DMEM w as supplemented w ith20%fetal calf serum.Isolated M SCs w er e passag ed to the third g eneration fo r identifying.Results Three gro ups o f M SCs w er e separated fro m4g roups of samples.By flow cytom etry analysising,cells expressed M SCs surface markers of CD29,CD44and CD105positively and CD34negatively.T he result of the differentiation of osteoblast like cells derived from human umbilical cord blood w as positive also.Conclusion We can easily and effectiv ely separ ate M SCs fro m human umbilical Cord Blood by thr ee phases appro ach.Key words:hum an um bilical co rd blo od;mesenchym al stem cells;in vitro culture人脐血间充质干细胞(umbilical cord blo od mesenchymal stem cells,U CB M SCs)具有良好的多向分化潜能,在适当的诱导条件下可以多向分化为间质谱系内的各种细胞[1-2],跨系分化为外胚层的神经细胞[3]、内胚层的肝细胞[4]。

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

干细胞提取和分离方法总结

干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。

干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。

1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。

目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。

- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。

这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。

- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。

然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。

这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。

2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。

提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。

这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。

- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。

相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。

3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。

主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。

- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法，并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。

方法：收集健康足月产胎儿脐带组织，采用组织块贴壁法进行原代培养，流式细胞仪对其表面标志进行检测，通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定，RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin 进行检测。

结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞，培养的细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29、CD44、CD105、CD106，低表达CD34、CD45；经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞，RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。

结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养，具有多向分化潜能，可作为组织工程种子细胞来源。

标签：人脐带间充质干细胞；原代培养；分离鉴定虽然胚胎干细胞具有全能性，可分化为各个胚层的细胞，但其来源还存在伦理和法律上的争议，且致瘤性目前还无法控制。

与胚胎干细胞相比，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）则因具有多向分化潜能、易培养、扩增能力强、来源广等优势而被大量用于实验和临床研究。

在各种成人干细胞中，目前研究较多的是骨髓MSC，因其可以作为自体移植的干细胞来源。

但骨髓的获取属于侵入性检查，来源有限，且骨髓MSC的量、增殖效率、分化潜能有着明显的个体差异，会随着年龄的增加而显著减少，因此寻找新的干细胞来源成为当务之急。

研究發现，可以从多种组织如骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘等中分离得到MSC。

相比骨髓，脐带属于医用废弃物，具有较低的免疫原性，容易获得，相对纯净，不会给供者带来痛苦，致瘤性、病毒和细菌污染的可能性均较骨髓MSC 低。

此外，与骨髓MSC相比，人脐带MSC（human umbilical cord MSC，hUCMSC）具有更强的增殖能力，其独特的多潜能特性能在体外保留更长时间，因此成为干细胞研究的重要来源。

人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析

人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。

方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。

结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。

②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。

③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。

④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。

结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。

关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。

本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。

一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。

1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。

人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

·研究原著·
郭莹1，王秀伟2，牛玉虎3，王莉1，周楠4，李佰一1，王振东1，张蘋1，高亚杰1，牛勃3 (1山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030001；2首都儿科研究所，北京市 100020；山西医科大学，3生物化学与分子生物学教研室，4解剖教研室，山西省太原市
郭莹，女，1993 年生，山西省临汾市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事干细胞治疗研究。
通讯作者：牛勃，教授，博士生导师，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
文题释义：外泌体：是由多种细胞分泌的直径在 30-100 nm 的亚细胞微泡结构，具有其来源细胞的基本生物学特性。较干细胞而言，外泌体具有易于保存、生物学特性稳定等优点，其在干细胞替代疗法中起到了很重要的作用。现阶段关于外泌体的提取方法有超速离心法、试剂盒法、密度梯度离心法等，但仍没有统一的标准，因此筛选出最优的提取方法是目前急需解决的问题。外泌体的生物学特性：①异质性，主要表现在物理性质上，因其粒径、密度、沉降系数不同于其他细胞分泌的囊泡而得以分离与鉴定；②靶向性，外泌体的分泌方式是由内吞小体出泡排出体外，此分泌方式也决定了其在细胞信息传递中的作用，目前国内外研究发现其较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制，而且其通路是特定的；③稳定性，主要依靠其表面的脂质层，可以保护其不被破坏。
Comparison of exosome extracting methods from human umbilical cord mesenchymal stem cells

人脐带间充质干细胞细胞外囊泡四种分离方法的比较

细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell Mol lm mU n〇l)2020, 36( 10)897 .论著•文章编号：1007 -8738(2020)10 -0897 -06人脐带间充质干细胞细胞外囊泡四种分离方法的比较贺静\邓陶然2,李长勇、李豫峰2,武栋成吴明富#C武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉430072; 2华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心；3武汉汉密顿生物科技股份有限公司研发中心，湖北武汉 430075; 4华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，湖北武汉430030)[摘要]目的比较四种方法所提取的人脐带间充质干细胞细胞外囊泡（EV)的效率。

方法收集人脐带间充质干细胞的培养基上清液，通过差速离心法（方法A)、超滤结合差速离心法（方法B)、超滤结合聚乙二醇沉淀法（方法C)、超滤结合水两相系统法（方法D)提取EV。

利用二辛可宁酸（BCA)蛋白浓度测定试剂盒检测各组E V的总蛋白浓度，Western blot法检测EV表面标志物凋亡关联基因2相互作用蛋白X(Alix)、CD9与阴性对照钙连蛋白（calnexin),透射电镜检测E V的形态，纳米颗粒跟踪分析检测EV的粒径分布与颗粒数。

结果以上四种方法提取的E V蛋白含量分别为（1.92 ± 1.77)46/p L、（18. 10 ± 1.07W|xL、（S G J S U S.I S W m X。

A、B、C三种方法所分离的 EV的CD9、Alix均呈阳性，其中方法 C的表达量最低；阴性蛋白calnexin均呈阴性。

方法D所得EV检测CD9、Alix、calnexin均呈现阴性。

A、B、C三种方法提取的 EV颗粒数分别为0.85 x10"/mL、0.63 x10n/mL、1.83 x10"/mL,且粒径分布均符合细胞外囊泡的粒径范围。

透射电镜检测 A、B、C三种方法所提EV均有典型的杯托状膜结构。

一种人脐带间充质干细胞的制备方法

一种人脐带间充质干细胞的制备方法人脐带是新生儿和胎儿连接母体的管道，内部含有丰富的干细胞，包括造血干细胞、免疫干细胞和间充质干细胞等。

其中，间充质干细胞是一种可以分化成多种不同类型的细胞，具有广泛的应用前景。

本文将介绍一种人脐带间充质干细胞的制备方法。

1.制备人脐带间充质干细胞的前期准备从分娩后的脐带中收集脐血，并将脐血中的红细胞和白细胞去除。

去除白细胞的方法有多种，常用的方法是采用不同浓度的低分子量明胶，使白细胞黏附于明胶上被去除。

脐血中包含的间充质干细胞比较少，因此需要进行进一步的扩增培养。

在扩增培养前，需要将获得的间充质干细胞进行鉴定，选择细胞表面标志物为CD29、CD44、CD90、CD73等呈阳性的细胞，且表面标志物CD34、CD45等呈阴性，以确保所选取的细胞圆形度好、生长正常并且快。

2.间充质干细胞的扩增培养将选定的间充质干细胞进行扩增培养，常用的培养基为DMEM/F12配合10%胎牛血清。

在扩增过程中，需要注意控制细胞密度，避免细胞过于密集造成细胞发生选代性缺失等问题，同时需要定期更换培养基和处理细胞的碎片等细胞代谢产物。

3.间充质干细胞的纯化在细胞培养达到稳定后，可以通过多种方法对间充质干细胞进行纯化。

浓差梯度离心把细胞移至无细胞半透膜，可使用巨噬细胞捕获或磁珠法，也可以使用化学方法如葡聚糖（PHA）等选择性粘附。

（需要具体结合实验条件选择对应的纯化方法）4.稳定存储间充质干细胞将纯化后的间充质干细胞存储在液氮中，或者进行低温保存。

在液氮中保存时，需要将细胞培养基中添加10% DMSO均匀混合。

存储前需要领到细胞的质量，包括鉴定细胞表面标志物、存放条件及能否继续生长。

总之，人脐带间充质干细胞制备方法主要包括前期准备、细胞扩增培养、细胞纯化和稳定存储。

进行干细胞的制备过程需耐心、谨慎、负责，可为干细胞研究提供有利载体。

两种分离脐血间充质干细胞的方法比较

两种分离脐血间充质干细胞的方法比较高杨;李立;冉江华;陈奕明;蒋益舟【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)019【摘要】背景:目前分离脐血间充质干细胞的方法很多,尚没有确定一种为最有效的方法.目的:寻找一种最为可靠的脐血间充质干细胞分离方法.方法:应用Percoll分离液法和羟乙基淀粉沉降法对脐血进行分离得到单核细胞,在含体积分数15%新生牛血清的DMEM/F12培养基中进行培养并传代.观察不同分离方法脐血单核细胞的回收率,每次传代的时间和细胞增值速度,培养过程中间充质干细胞形态的变化情况,并用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD90、CD44、CD34的表达.结果与结论:与Percoll分离液法相比羟乙基淀粉沉降法获得的单核细胞多,单核细胞回收率高(P < 0.01),第1次传代时间短(P < 0.01).然而两种方法获得的细胞经培养在形态的变化和表面标志物CD90、CD44、CD34的表达上差异并无显著性意义(P > 0.05).所以羟乙基淀粉沉降法的分离效率较高,培养时间短,但是并不能获得质量较高的脐血间充质干细胞.%BACKGROUND: There is no standard method to isolate umbilical cord blood mesenchymal stem cells (MSCs).OBJECTIVE: To discuss an optimized isolation method of human umbilical cord blood MSCs.METHODS: Monocytes were isolated from umbilical cord blood using the Percoll separation medium method and hydroxyethyl starch sedimentation respectively. Cells were cultured in DMEM/F12 containing 15％ newborn calf serum. The main outcome indictors were recovery rate of monocytes, generation time, cell proliferation, morphological change,and the surface markers expressed on umbilical cord blood MSCs measured by flow cytometer.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the Percoll separation medium method, the recovery rate of monocytes increased and the first passage time reduced using the hydroxyethyl starch sedimentation (P ＜ 0.01). But the morphological change and surface markers CD90, CD44, CD34 expression of two methods have no differences (P ＞ 0.05). Therefore, the hydroxyethyl starch sedimentation has higher isolation efficiency and the shorter culture time than Percoll separation medium method. However, the quality of umbilical cord blood MSCs which are isolated by two methods has no difference.【总页数】4页(P3472-3475)【作者】高杨;李立;冉江华;陈奕明;蒋益舟【作者单位】昆明市第一人民医院肝胆胰一科,云南省昆明市,650011;昆明市第一人民医院肝胆胰一科,云南省昆明市,650011;昆明市第一人民医院肝胆胰一科,云南省昆明市,650011;昆明市第一人民医院肝胆胰一科,云南省昆明市,650011;昆明市第一人民医院肝胆胰一科,云南省昆明市,650011【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较 [J], 吴瑞影;许建华2.两种人脐带间充质干细胞源外泌体分离方法的比较 [J], 刘高米洋;潘兴华;和法莲;陆容;刘菊芬;何洁;王红阳3.两种不同分离方法的唾液多肽组分析结果比较 [J], 孔祥怡; 杜建时; 徐金玲; 李水明; 王勇; 赵晴4.两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较 [J], 曹卉;王薇;肖敬川;黄邓高;高元慧;朱丹5.人脐血间充质干细胞两种移植方法在骨折模型中比较研究 [J], 刘宝平;李永乐;郑铁钢;范先东;李铁军;孙义忠;郝珍珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。