人脐带间充质干细胞操作规范

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脐带间充质干细胞制备操作规程

1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。

去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。

充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。

静置培养7天。

第8天根据生长情况，进行换液、传代。

2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。

用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。

3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。

1200rpm，离心6min，弃上清。

合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。

根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。

1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。

加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。

弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。

冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。

利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。

脐带间充质干细胞培养操作细则

脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

2.查看客户信息是否与交接表一致。

3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。

二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。

50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。

将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。

拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。

使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。

6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。

清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。

再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。

7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。

脐血间充质干细胞的培养

脐血间充质干细胞的培养
一、试剂：
胰酶、DMEM/F12培养基、胎牛血清、冻存管及二甲基亚砜(DMSO)、淋巴细胞分离液( 比重1.077g/cm3 ) 。

二、人脐血MSCs 分离和培养
1、无菌条件下采集脐带血，每份40～100 ml，肝素抗凝(20 U/ ml)，所有标本要求在6 h 内分离接种。

2、将人脐血沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(比重1. 077 g/ cm3 )上，2000 r/min 离心20 min (离心半径15 cm)，取中间白膜层，PBS 洗涤2 次。

3、取洗涤后细胞1×107个接种于含30 % FBS 的DMEM/F12培养基中，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养，7d 后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每隔2d 全量换液1次。

4、当MSCs 达到80 %融合时，1 ∶2 常规消化传代。

三、人脐血MSCs 的冻存和复苏
1、冻存
取第3 代1 ×106个MSCs 加入1 ml 含10 % DMSO 和90 %FBS 的冻存液，吹打均匀后移入冻存管，采用非程序性降温液氮冻存法进行细胞冻存，冻存管依次置于4 ℃冰箱20 min，- 20 ℃冰箱30 min 和- 80 ℃冰箱过夜，第2 d 移入- 196 ℃液氮中冻存。

2、冻存4周后复苏细胞，即从液氮中取出冻存管立即置于37 ℃水浴并轻轻摇动，1 min 内迅速解冻；冻融后的MSCs 加入含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基洗涤2次，然后接种到含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基中，置37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，第2 d 全量换液。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞1 资料与方法1.1 一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4C保存，6h内无菌处理。

1.2 脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's 液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton 胶。

将其剪碎至1mm31织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20〜25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37 C，体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

3〜5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%台牛血清的DMEM/F1培养基，正向放入体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d 可有间充质干细胞爬出。

1.3 脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F1（2 不含酚红）、StemProRMSC SFM 三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

1.4流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1X 106个细胞，分别加入10 u l单克隆抗体CD73 CD34 CD45 CD105 HLA-DRHLA-ABC及阴性对照lgG1 -PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min, PBS洗涤两次，室温300g, 5min。

PBS重悬后上流式细胞仪。

1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4 代细胞，调整细胞浓度至0.2 X 105/ml，加入96孔板。

每孔90卩l放在37C、体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内培养。

7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100卩l换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。

用酶标仪波长450nm测定各孔OD 值。

以OD直代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。

脐带MSCs培养操作规程

脐带MSCs培养操作规程
1 无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的PBS中，玻璃容器密封送回实验室；
2 超净台上剪取约2cm长的脐带，剖开动静脉，用PBS洗净血污；
3 将脐带剪碎成肉糜状，转移到离心管中，可按以下两种方法分离脐带间充质干细胞：①加入4ml的消化液（含0.25%胰酶，200~400U 胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃中消化1小时，每隔10分钟振摇一次；②加入4ml消化液（200~400U胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃中消化过夜；
4 吸取消化上清，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12培养基（含10~15%胎牛血清），37℃、5%CO2孵箱培养；
5 约三天左右能在显微镜下观察到贴壁细胞，半量换液后继续培养，三天后换液，细胞已经能稳定生长。

每三天换液一次，至细胞生长铺满瓶底（约10天左右），即可进行传代；
6传代时去除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞一次，加入3 ml的消化液（含0.25%胰酶的PBS液），37℃条件下作用10min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到15 ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清，用适量DMEM/F12培养基重悬细胞，传代比例为1:2，接种量为5ml/瓶，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

7 细胞冻存时，按传代的操作步骤获得细胞沉淀，用冻存液（90%FBS ＋10%二甲基亚砜）重悬细胞，调整细胞浓度为1×108/ ml，将细胞悬液转移到冻存管中，1ml/管，用程控降温仪降温后转移到液氮中冻存。

人脐带间充质干细胞及外周静脉移植SOP课件

05
问题与展望
目前存在的问题
安全性问题
目前关于人脐带间充质干细胞及外周静脉移植的安全性仍存在争议，需要进一步的研究来验证其
长期效果和潜在的副作用。
移植效率低
目前人脐带间充质干细胞的移植效率相对较低，如何提高移植后的细胞存活率和功能发挥是需要解决的关键问题。
伦理问题
由于涉及到人类胚胎干细胞的采集和使用，因此存在一定的伦理道德问题，需要制定相应的伦理规范和法律法规。
潜在的应用前景
1 2 3
治疗多种疾病人脐带间充质干细胞及外周静脉移植有望成为治疗多种疾病的新方法，如糖尿病、帕金森病、脊髓损伤等。
个性化治疗利用人脐带间充质干细胞进行个性化治疗，根据患者的具体情况定制治疗方案，提高治疗效果。
促进组织再生和修复人脐带间充质干细胞具有促进组织再生和修复的能力，有望在损伤修复、整形外科等领域发挥重要作用。
干细胞来源与获取
来源
人脐带是hUC-MSCs的主要来源，通常在新生儿出生后由产科医生提供。
获取方法
通过特定的分离和培养技术，从脐带中提取出间充质干细胞，并进行扩增和储存。
干细胞的分化与增殖能力
分化能力
hUC-MSCs具有多向分化潜能，能够分化为多种组织细胞类型，如骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等。
增殖能力
hUC-MSCs具有强大的增殖能力，能够在体外培养条件下进行大量扩增，以满足临床治疗的需求。
02
外周静脉移植概述
移植方式与途径
移植方式
外周静脉移植是一种常用的移植方式，通过将干细胞注入外周静脉，使干细胞随血液流动至全身各组织器官。
移植途径
外周静脉移植的途径通常包括自体移植和异体移植，自体移植使用患者自身的干细胞，而异体移植则使用他人的干细胞。

脐带间充质干细胞培养方法

(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离_培养_鉴定及冻存_复苏

见明显钙结节;成脂诱导 14 d，有明显的脂滴出现，油红 O 染色阳性。冻存再复苏细胞活力达 80%，细胞免疫表型及成
骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充
质干细胞，冻存、复苏不改变其特性。
[关键词] 人脐带间充质干细胞；华通氏胶；细胞培养；诱导分化；冻存
定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力；将 P1 细胞冻存 6 个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人
脐带华通氏胶中获得间充质干细胞；组织块贴壁后 6 d 可见组织块周围细胞爬出，原代培养 14~18 d 细胞融合 70%~
80%；P3 代细胞强烈表达 CD73、CD90、CD105，不表达 CD14、CD34、CD45、CD79a 和 HLA-DR；成骨诱导分化后 10 d，可
图 1 剪成 2 cm 脐图 2 剔除脐静脉图 3 剥离的华通
带小段
及脐动脉
氏胶
1.2.2 脐带华通氏胶 MSCs 表型的测定用流式细胞仪对 P3 代 UC-MSCs 表面特异性抗原进行检测。 Tryple 酶消化待检细胞，PBS 洗涤 3 次，制成 1×106/ml 的细胞悬液。将待检细胞样品分为每管 0.1 ml，加入 CD14 -FITC、CD45 -FITC、CD79a -APC、CD90 -APC、 CD34 -PE、CD73 -PE、CD105 -PE、HLA -DR -PE 一抗，4 ℃孵育 30 min，流式细胞仪测定各类抗原的阳性率。 1.2.3 脐带华通氏胶 MSCs 诱导分化向成骨细胞诱导分化：将 P3 代细胞消化后，调整细胞密度为 1×105/ml，接种于 24 孔板内，1~2 d 后细胞融合达 70%~80%，此时以成骨细胞诱导培养液培养，每 3 天全量换液 1 次，第 10 天茜素红染色；向脂肪细胞诱导分化：培养液改为成脂肪细胞诱导培养液，其余同前，第 14 天油红 O 染色。 1.2.4 脐带华通氏胶 MSCs 的冻存、复苏将 P1 代

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

脐带间充质干细胞制备操作规程

1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。

去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。

充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。

静置培养7天。

第8天根据生长情况，进行换液、传代。

2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。

用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。

1200rpm，离心6min，弃上清。

合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。

根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。

1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。

加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。

弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。

冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。

利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离_培养_鉴定及冻存_复苏

MSCs 消化后以 1×106/ml 密度冻存，冻存液 DMSO∶ FBS∶DMEM 为 1∶1∶8，将冻存细胞放入 4 ℃预冷的程序冷冻盒内，直接将程序冷冻盒放入-80 ℃冰箱，第 2 天放入-196 ℃液氮保存。冻存 6 个月后将程序冷冻盒从-80 ℃冰箱取出，细胞直接放入 37 ℃预热的水浴锅内，用 4 ℃预冷的 PBS 洗涤细胞 2 遍，将细胞接种于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养瓶内，放入 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。待细胞传代至 P3 代时，用流式细胞仪检测 CD14、CD45、CD79a、CD90、 CD34、CD73、CD105、HLA-DR，并进行成骨细胞、成脂细胞诱导分化，方法同前。
YANG Xiaoqing1**, ZHANG Mu2, YANG Bing3, ZGANG Hu3, ZHANG Yuquan1***
(1Department of Gynaecology and Ob-
sterics, Affiliated Hospital of Nantong University; 2Department of Clinical Medical class 071, Medical College of Nantong U-
来源 MSCs 具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，正逐渐成为 MSCs 研究领域的热点之一。人脐带 MSCs 的来源有 4 种，其中华通氏胶(WJ)来源的 MSCs 含量丰富但对其分离培养的研究相对较少，本文就探讨从人脐带华通氏胶中分离出脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells， UC-MSCs)并进行体外培养、鉴定及定向分化，为 MSCs 的应用提供更广泛的来源。

人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准

人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准1. 引言人脐带间充质干细胞（Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种被广泛研究和应用的干细胞资源。

作为这个领域的重要组成部分，人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会（International Society for Cell & Gene Therapy）制定了一系列标准来定义人脐带间充质干细胞，这些标准不仅对于科学研究具有重要意义，同时也对于临床应用和治疗效果的评估至关重要。

2. WHO 推行的初衷和原则人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会的标准旨在确保干细胞的质量和安全性，以便更好地应用于细胞治疗领域。

这些标准不仅限定了干细胞的来源和特性，还包括细胞处理和存储的要求等。

通过制定这些标准，国际细胞治疗协会为临床研究和细胞治疗的发展提供了指导。

3. 人脐带间充质干细胞定义的关键指标根据国际细胞治疗协会的定义，人脐带间充质干细胞可以通过以下几个关键指标来判断：a. 来源：主要来源于脐带的Wharton's jelly组织，这是一种丰富而易获得的干细胞来源。

b. 表面标记：表达特定的免疫表面标记，如CD73、CD90、CD105等，并且不表达CD34、CD45等造血干细胞标记。

c. 多向分化潜能：具有分化为多种细胞类型的潜能，如骨、脂肪、软骨等。

d. 免疫抑制能力：具有调节免疫功能，可以抑制免疫反应和自身免疫性疾病等。

e. 活力和增殖能力：繁殖能力强，能够长时间维持干细胞特性。

4. 临床应用和治疗效果评估根据人脐带间充质干细胞的定义标准，科研人员和临床医生可以更好地评估细胞治疗的效果和潜在风险。

这些标准也为细胞治疗产品的质量控制和监管提供了依据，确保细胞治疗的安全性和可行性。

5. 对于干细胞研究和应用的启示人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准，不仅适用于人脐带间充质干细胞，也为其他干细胞类型的研究和应用提供了借鉴。

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min;2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min;5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿;7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min;8. 弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614. 细胞计数，按10/瓶接种，每瓶加入10 ml脐带无血清培养液(UltraCULTURE + 2% Ultroser G + 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液; 15. 细胞融合率达到80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。

人脐带间质干细胞分离培养方案

准备工作：
高压眼科剪、镊子等器材、大皿（可重复利用）、小皿、PBS、抗生素、营养液
1.经胎儿父母同意后取无菌新鲜脐带，尽快于6 h内用磷酸盐缓冲液
(PBS)反复冲洗以除去其表面附着的血液。

2.剔除脐带内部包裹的血管（包括2根脐动脉与1根脐静脉）后，
将剩余的脐带基质组织（含华通胶）浸泡于含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的PBS溶液中约15 min。

3.将脐带组织剪碎为约1 mm3大小的组织块，并直接贴附于不含任
何营养液的35 mm培养皿中，放置37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中以增强组织块的粘附力。

4.30 min后，取出含组织块培养皿，加入含10%胎牛血清(fetal
bovine serum, FBS) 的低糖DMEM，并置于37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱继续培养。

5.3～4天后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3天换液一次。

大
约培养10天左右，贴壁细胞开始从组织块中长出，待形成融合层时，剔除小皿中组织块，并用0.25%胰酶- EDTA-Na2溶液消化传代，接种于细胞培养瓶中以利于大量扩增。

待培养至第4代时，即可用于实验。

人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册说明书

产品描述人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册产品规格：400mL产品货号：PD-019人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基专门为人脐带间充质干细胞成脂诱导分化而开发，针对人脐带间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方，可增加人脐带间充质干细胞的成脂分化效果。

本产品含血清成分，仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。

培养基组成成分●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP1：成分名称添加体积175 mL 20 mL 2 mL 2 mL 400μL 200μL 200μL 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化诱导基础培养基 ADP1FBS谷氨酰胺 Glutamine青链霉素 Pennicillin-Streptomycin胰岛素 InsulinIBMX罗格列酮 Rosiglitazone地塞米松A Dexamethasone 200μL●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP2（维持培养基）成分名称添加体积人脐带间充质干细胞成脂诱导分化基础培养基 ADP2175 mL FBS20 mL 谷氨酰胺 Glutamine2 mL 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin2 mL 胰岛素 Insulin 400μL油红-O 染色液 10 m L操作流程一、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基的准备注：各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。

地塞米松A和地塞米松B浓度不同，不能混用。

染色液1.本产品为试剂盒型，使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。

（请勿将 ADP1 与 ADP2混淆）2.使用前，请将血清置于4℃解冻，直至血清完全溶解；待血清完全溶解后，将所有添加物置于室温溶解。

待试剂完全溶解后，轻轻摇晃使试剂混合均匀（低于 500μL 体积的试剂无需此操作）。

注：为了保证微量试剂的使用效果，请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心，使试剂能全部收集至管底。

3.按上述两个成分表，将表一 ADP1 中的 FBS、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松A等试剂按体积大小先后加入到诱导基础培养基中；混合均匀后做好标识，培养基即可使用。

人脐带间充质干细胞及外周静脉移植SOP

干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组
织。
2
我院干细胞移植的发展
1985年陈成伟研究小组，最早从早孕意外流产获得人胎干细胞静脉输注治疗肝功能衰减，被认为是一种广义同种异基因干细胞移植。被国家科委《七﹒五》重症肝炎攻关小组采纳，《七﹒五》期间，453例确认患者用人胎干细胞悬液静脉移植，死亡29例，病死率仅为33%。
3
干细胞的种类
☺脐带间充质干细胞 ☺ 脐带造血干细胞 ☺ 胚胎干细胞
4
间充质干细胞的概念
概念：它是干细胞的一种类型，具有外、中、
内胚层组织细胞分化的能力。它源自未成熟的胚胎结缔组织的细胞，是可形成多种细胞类型的多能干细胞。现在用得最多的是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞。
5
脐带间充质干细胞源
9
干细胞在医学领域的应用
☺ 肝硬化
☺ 造血功能与免疫功能的再生治疗 ☺ 心血管疾病 ☺ 骨和肌肉衰退性疾病 ☺ 脑及脊髓神经损伤 ☺ 老年痴呆及红斑狼疮 ☺ 硬皮病 ☺ 自身免疫性疾病 ☺ 美容、保健、抗衰老等方面显示了巨大的应用潜力。
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人脐带间充质干细胞移植SOP
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脐带间充质干细胞移植常用方法
注意点
☺ 细胞必须在避免高温、高湿及日光直射的场所保存
☺ 使用中应及时确认本品是否破损、接合部分是否有松动及漏液，发现漏液等故障时，应立即停止使用；
☺ 包装开封后应立即使用细胞。
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使用后相关细胞包装的保存及销毁
☺ 干细胞移植外包装盒交给研究医生统一保存在研究者文件夹对应处。 ☺ 细胞悬液包装需保存在4－10℃的环境48小时后，如患者无可疑不良事件发生，即可按照SOP要求销毁，并填《临床研究用细胞回收销毁表》；如发生可疑不良事件，请将细胞悬液袋移交至专门实验室对细胞进行监测，并在护理记录单上及CRF表中如实记录，并采取相关临床对症处理。