酶切位点保护性碱基的添加原则
酶切保护碱基表 引物设计原则
PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
不能选择A，最好选择T⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA 序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基引物设计是PCR实验的关键步骤之一，引物的好坏会直接影响到PCR反应的成功与否。
而在引物设计过程中，酶切位点的保护碱基是需要考虑的重要因素之一在PCR实验中，引物的作用是指定PCR反应的放大区域，并提供启动位点供聚合酶结合。
一般情况下，引物至少需要包含一段特定的DNA序列，以便与目标序列互补配对。
在引物设计过程中，选择合适的酶切位点是十分必要的。
酶切位点是指位于特定DNA序列上的限制酶可以识别并切割的区域。
酶切位点的选择通常需要考虑如下几个方面：1.切割效果：选择切割效果好的酶切位点可以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
经典的选择是选择一种具有4-6个碱基的酶切位点，并且该位点在引物中间的位置。
这可以有效防止酶切位点的保护碱基对PCR反应的影响。
2.特异性：引物需要选择适合的酶切位点，以确保只有目标序列被放大，而不包括其他与之相关的非特异性序列。
因此，在选择酶切位点时应尽量避免与其他非特异性序列存在相似性。
3.引物长度：引物长度的选择也与酶切位点相关。
如果引物长度过短，可能会导致酶切位点过于靠近PCR反应产物的端点，从而使切割效果不佳。
因此，在引物设计时，应选择适当的引物长度，以保证酶切位点的保护碱基不会对PCR反应产物的生成产生不利影响。
酶切位点的保护碱基是指在特定的DNA序列上，通过选择相应的碱基来避免受到酶切的影响。
常见的保护碱基有甲基化碱基、磷酸化碱基以及接上阻断扩增的非互补碱基等。
1.甲基化碱基：将酶切位点中的一些碱基进行甲基化处理，可以有效地阻止特定酶的切割作用。
甲基化碱基可以通过DNA甲基转移酶进行甲基化修饰。
2.磷酸化碱基：磷酸化碱基是在引物设计过程中添加磷酸基团的方法，通过给酶切位点添加一个磷酸基团来阻断酶的切割作用。
3.非互补碱基：为了阻断酶切位点的切割作用，可以在酶切位点的周围引入一个与其不互补的碱基序列。
这样可以阻断酶的结合和切割。
总的来说，选择合适的酶切位点和保护碱基对PCR实验的成功至关重要。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。
取1 Q已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20° C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的NaCl 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE （7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2. 双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点是指特定的序列，酶可以识别并在该位置切割DNA分子。
这些位点的特异性使得酶在分子生物学中广泛应用于DNA片段的定位和切割。
然而，在一些实验中，我们可能需要保护酶切位点周围的碱基，以免酶切，并且只在特定的位置引导酶切。
因此，保护碱基引物的设计对于实验的成功非常重要。
以下是保护碱基引物设计的一些建议。
首先，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度。
引物的长度通常为18到30个碱基，具体的长度需要根据实验的需求和酶切位点周围的序列特征来确定。
引物的长度应足够长，以确保引物和靶序列的特异性，但不应过长，以免引物形成二级结构或与非特异性位点结合。
其次，保护碱基引物的设计需要考虑引物的碱基组成。
在设计引物时，建议尽量避免引物中出现酶切位点周围的碱基序列，以防止酶的误切。
例如，如果我们希望保护酶切位点周围的AATTC序列，可以设计一个引物，其中没有AATTC序列。
同时，引物的碱基组成应尽量避免多聚核苷酸或含有GC碱基的片段，以防止引物之间的结合或引物与非特异靶序列的结合。
此外，保护碱基引物的设计需要考虑引物的特异性。
在设计引物时，建议使用特异性的引物序列，以确保引物只与目标酶切位点结合。
可以通过使用生物信息学工具，如BLAST，来验证引物的特异性。
引物的特异性还可以通过调整引物的长度和碱基组成来进一步提高。
最后，保护碱基引物的设计需要考虑引物的热力学性质。
引物的热力学性质包括引物的熔解温度（Tm值）和引物之间的配对。
引物的Tm值与引物的碱基组成、长度和引物与靶序列之间的碱基配对相关。
可以使用在线工具，如NEB的Tm计算器，来计算引物的Tm值，并对不同的引物进行比较。
此外，引物之间的配对可以通过设计引物的末端序列来调整，例如末端的碱基配对或非配对等。
总结起来，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度、碱基组成、特异性和热力学性质。
通过合理设计引物，可以保护酶切位点周围的碱基，并在特定位置引导酶切，为实验的成功提供有力的保障。
引物设计时酶切位点的保护碱基表
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
有研究者使用了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。
结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。
一般来讲，在酶切位点前加入两个GC碱基，因为如果保护碱基为A T的话,保护碱基在PCR 产物的末端,A T之间只有两个氢键,结合力差,容易在末端产生单链,这样的话限制性内切酶就无法作用。
其实加保护碱基的多少，是具体情况具体讨论，比如HindIII、BamHI等就得有三个保护碱基，少了一个就无法切动。
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
保护碱基添加原则
0
0
0
0
0
0
0
0
75
>90
75
>90
Nhe I
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
0
0
10
25
10
50
Not I
TTGCGGCCGCAA
0
0
ATTTGCGGCCGCTTTA
10
10
AAATATGCGGCCGCTATAAA
10
10
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
0
0
>90
>90
>90
>90
Mlu I
GACGCGTC CGACGCGTCG
0
0
25
50
Nco I
CCCATGGG CATGCCATGGCATG
0
0
50
75
Nde I
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
25
>90
Nsi I
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
>90
>90
>90
Pac I
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
0
0
0
25
0
>90
Pme I
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。
取1 Q已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20° C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的NaCl 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE （7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2. 双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
关于保护碱基
关于保护碱基1.首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA 作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
2.添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
3.添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点的保护碱基引物设计在分子生物学领域中起着至关重要的作用。
它们是研究者在酶切实验中必不可少的工具，用于保护酶切位点周围的碱基，以避免酶的切割作用。
本文将介绍保护碱基引物设计的一般原则和具体步骤，并探讨一些常见的问题和注意事项。
保护碱基引物设计的一般原则如下：1.引物长度：保护碱基引物的长度通常为15-25个碱基对。
2.引物序列：引物应根据酶切位点的序列设计。
为了确保引物的特异性，通常将酶切位点和其周围的碱基考虑在内。
3.引物组成：引物的核苷酸组成应考虑碱基的GC含量，以保持引物的稳定性。
通常，GC含量高于50%的引物更稳定。
4.引物末端修饰：引物的末端修饰可以提高引物与目标DNA的亲和性，并增加引物的稳定性。
常用的末端修饰包括磷酸化和胺基修饰等。
保护碱基引物设计的步骤如下：1.获取酶切位点序列：首先，需要获取目标DNA序列中待保护的酶切位点的序列。
2.引物设计：根据酶切位点的序列设计引物。
引物的长度通常为15-25个碱基对。
为了提高特异性，可以考虑在引物序列中加入一些限制性内切酶无法识别的碱基。
3.引物末端修饰：根据需要选择引物的末端修饰方式，例如磷酸化和胺基修饰等。
4.引物的合成：完成引物设计后，可以委托专业的生物科技公司进行引物的合成。
确保引物的纯度和质量。
在进行保护碱基引物设计时，还需注意一些常见的问题和注意事项：1.引物特异性：在设计引物时，要确保引物与目标DNA的序列具有高度特异性，以避免引物与非目标区域的杂交。
2.引物的稳定性：引物的稳定性对于酶切实验的成功至关重要。
在设计引物时，要尽量选择稳定的引物序列，例如具有较高GC含量的引物。
3.引物纯度和质量：为了保证引物的质量和稳定性，引物的合成必须由专业的生物科技公司进行。
确保引物的纯度高，无杂质。
4.引物的浓度和稀释：在使用引物进行酶切实验时，要合理确定引物的浓度和稀释倍数，以保证实验的成功。
总之，保护碱基引物设计是分子生物学研究中不可或缺的一部分。
常用酶切位点序列和保护碱基
常用酶切位点序列和保护碱基引言在分子生物学和遗传工程领域，酶切位点序列和保护碱基是非常重要的概念。
酶切位点序列指的是DNA或RNA上特定的核苷酸序列，这些序列可以被特定的酶识别并切割。
保护碱基则是指在实验过程中采取措施来保护DNA或RNA上特定的核苷酸，使其不被酶切割。
本文将对常用的酶切位点序列和保护碱基进行详细介绍，包括其定义、常见的酶切位点序列、如何选择合适的保护碱基等内容。
酶切位点序列定义酶切位点序列是指DNA或RNA分子上具有一定规律性、可以被特定的限制性内切酶识别并结合从而发挥催化作用的核苷酸序列。
这些限制性内切酶通常能够识别4-8个核苷酸，并在识别到相应的位点后将DNA或RNA分子切割成片段。
常见的酶切位点序列1.EcoRI: 5’-GAATTC-3’，3’-CTTAAG-5’2.HindIII: 5’-AAGCTT-3’，3’-TTCGAA-5’3.BamHI: 5’-GGATCC-3’，3’-CCTAGG-5’4.XhoI: 5’-CTCGAG-3’，3’-GAGCTC-5’5.NotI: 5’-GCGGCCGC-3’，3’-CGCCGGCG-5’这些酶切位点序列是常用的限制性内切酶的识别序列，它们在分子生物学实验中被广泛应用。
通过将DNA或RNA与特定的限制性内切酶一起反应，可以实现DNA或RNA的特定部位切割。
保护碱基定义保护碱基是指在实验过程中采取措施来保护DNA或RNA上特定的核苷酸，使其不被酶切割。
这种保护通常通过对特定的碱基进行修饰或使用化学试剂来实现。
如何选择合适的保护碱基选择合适的保护碱基需要考虑以下几个因素： 1. 酶切位点序列：首先要了解所使用的限制性内切酶的酶切位点序列，以确定需要保护的碱基。
2. 保护方法：根据实验需求和实验条件选择合适的保护方法。
常见的保护方法包括使用化学修饰剂修饰碱基、使用特殊的核苷酸引物或引入特定的修饰基团等。
3. 保护效果：选择的保护碱基应能够有效地阻止限制性内切酶与目标位点结合并发挥催化作用。
酶切位点保护碱基
本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A26单位的寡核苷酸。
取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 00°C条件下分别反应2小时和20小时。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核昔酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1 A 260单位的寡核昔酸。
取1 Q已标记了的寡核昔酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6） , 10 mM MgCI 2,5 mM DTT S适量的NaCI 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核昔酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90参看目录，选择共同的buffero其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
切。
3. 酶切底物DNA ,切不开1 ）底物DNA±没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
保护碱基——精选推荐
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
有研究者使用了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。
结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。
一般来讲，在酶切位点前加入两个GC碱基，因为如果保护碱基为AT的话,保护碱基在PCR产物的末端,AT之间只有两个氢键,结合力差,容易在末端产生单链,这样的话限制性内切酶就无法作用。
其实加保护碱基的多少，是具体情况具体讨论，比如HindIII、BamHI等就得有三个保护碱基。
少了一个就无法切动。
保护碱基的作用限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
保护性碱基添加原则
保护性碱基添加原则
保护性碱基添加原则是一种被广泛应用于合成生物组学和分子生物学研究中的
一种关键技术，这种技术在改进DNA成像，DNA测序，蛋白测定和其他技术中发挥
了重要作用。
保护性碱基添加原则是一种合成的技术，它的基本原理是对DNA中的碱基，特
别是甲基化的碱基进行保护，通过添加分子印迹（MIP）或等体系序列控制技术（SCL），只有特定位点才可生物合成。
这可以有效保护DNAs免受酶水解反应的影响，使细胞不会丢失有用的信息，从而可以获得更准确和准确的信息。
保护性碱基添加方法可以提高基因组学研究的准确性，包括突变、同源性研究
和比较功能基因组学。
此外，这种技术可以更好地分析基因的特征和功能，并可以实现精确的DNA合成和测序，及时有效地研究比较酶类活性，鉴定异常蛋白组和基因调控机制。
保护性碱基添加技术可以提高很多生物学和分子生物学研究中的效率，比如可
以提高重组DNA的精度和准确性；可以缩短DNA连接的时间，减少繁琐的操作过程；可以显著减少研究者使用的物质资源，节约实验成本；可以提高基因突变鉴定、微生物多样性和蛋白质结构功能研究的准确性。
通过运用保护性碱基添加原则，人们可以更好地对细胞内DNA，RNA和蛋白质
产物进行检测，并从而获得深入和准确的信息，可以说，这是生命科学研究取得重大进展的关键技术之一。
酶切位点保护碱基---精品管理资料
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GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
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PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
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上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3‘端加保护碱基，就在酶切位点识 别碱基序列（红色）的 3’端加上相应的碱基（黑色）。 2．切割率：正确识别并酶切的效率 3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
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注释： 1．如果要加在序列的 5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5’端加
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