定量pcr检测酚氯仿抽提效率

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定量pcr检测酚氯仿抽提效率解析

荧光定量PCR检测酚氯仿抽提效率摘要：探讨荧光定量PCR检测sf9细胞内杆状病毒拷贝数测定过程中酚氯仿抽提的效果。

方法：用荧光定量PCR检测在酚氯仿抽提DNA的过程中无关DNA（鱼精DNA）对DNA的抽提效果的影响。

结果：经过荧光定量PCR检测杆状病毒的拷贝数，在含有50ng/ul 无关DNA的检测样品中抽提率为73.6%，在不含有无关DNA的检测样品中抽提率为2.82%；在含有25ng/ul、50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul无关DNA的检测样品中抽提率已100ng/ul最为显著结论：荧光定量PCR检测标准液中杆状病毒准确灵敏，可精确的反应出在抽提过程中DNA的抽提效果，与使用传统抽提方法相比，在抽提过程中加入无关DNA 可显著提高目的DNA的抽提效率。

关键词：无关DNA 荧光定量聚合酶链式反应酚氯仿抽提效果Abstract: this paper studies the FQ-PCR detection sf9 quantitative fluorescence inside cells cn sindbis virus during the process of determining the effect of phenol chloroform extraction. Methods: using fluorescence quantitative PCR detection in phenol chloroform extraction DNA process irrelevant DNA (the fish for pure DNA) the extraction effect. Results: after fluorescence quantitative PCR detection baculovirus cn, in the 50ng/ul irrelevant containing DNA testing samples for extraction rate 73.6%, in does not contain DNA testing samples irrelevant for the extraction rate 2.82%; In 25ng/ul, containing 50ng/ul, 100ng/ul, 200ng/ul irrelevant DNA testing samples of extraction rate has 100ng/ul in the most significant conclusions: fluorescent quantitative PCR detection standard fluid baculovirus accurate sensitive to accurately reflect in the extraction process of DNA extraction effect, and use traditional extraction method compared, in the extraction process to join irrelevant DNA can significantly improve the purpose of DNA extraction efficiency.基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。

酚氯仿法提取dna注意事项

酚-氯仿法提取DNA时，需要注意以下几点：
1. 在吸取基因组DNA时，需要使用专用的粗口吸头，避免使用普通的吸头，因为这可能会切断或损坏DNA。

2. 在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上，以保持其低温状态。

3. 加缓冲液后，可以轻轻晃动或轻弹试管，以加速DNA的溶解。

4. 加入缓冲液后，可以置于4度过夜，这样也有助于溶解DNA。

5. 将DNA溶液在65度下温育10分钟，可以灭活DNase，防止其降解DNA。

6. 在抽提过程中，如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，这时可以增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。

7. 在酚抽提过程中，如果上清液太粘稠而无法进行水相转移，可以加入适量TES稀释后再抽提。

8. 氯仿的作用是克服酚的缺陷，加快有机相与液相的分层，最后用氯仿抽提出DNA。

由于酚易溶于氯仿中，可以快速去掉核酸溶液中的微量酚。

9. 加入异戊醇能减小分子表面张力，减少抽提流程中的泡沫发生。

通常选用氯仿与异戊醇为24:1的比例，异戊醇可
以帮助分相，使离心后的上层水相、下层有机溶剂相、中层变性蛋白相保持稳定的层次。

以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。

酚-氯仿抽提DNA

方法一细菌沉淀加入567μlTE溶液(10mmol/L Tris- HCl , 1mmol/L EDTA, pH810) 重悬,加入10%SDS30μl 和20mg/ml 蛋白酶K3μl , 于37 ℃温育1h,加入5mol/LNaCL100μl , CTAB/NaCl 80μl 溶液, 于65 ℃温育10min,加入等体积的氯仿/异戊醇, 混匀, 4 ℃12000g/min离心5min。

将上清液转入另1个离心管中加等体积的酚/氯仿/异戊醇, 混匀, 4 ℃12000g/min 离心5min,提取上清置于另一管中, 加入0.6体积异丙醇, 轻柔混合, 4℃12000g/min离心5min, 弃上清加入70%乙醇洗涤1min, 离心, 弃上清, 将沉淀的DNA溶于100μl 的无菌去离子水中, - 20℃保存备用方法二取 1.5 mL 培养至对数生长期的菌液于 2.0 mL 的离心管中，8 000 r/min 离心5 min，弃上清；加入600 μL 消化液（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，1% SDS，200μg/mL蛋白酶K，20μg/mL RNase A），37℃消化30 min ；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25 /24/ 1）混合液，轻摇10 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清，重复抽提1次；加入等体积的氯仿/异戊醇（24 /1）混合液抽提 1 次；加入1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠和 2 倍体积的冰乙醇混匀，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清；沉淀加入 1 mL 70%乙醇洗涤2次，每次8 000 r/min 离心 5 min，弃乙醇，待沉淀中残余乙醇挥发后，加入50μL 超纯水溶解DNA。

4℃保存备用。

方法三将预处理后所得沉淀加入300μL细胞裂解液（主要成分：10mmol/L Tris-HCl 缓冲液、1mol /L 氢氧化钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、生理盐水、0.2%十二烷基硫酸钠），振荡混匀，于100℃加热15min。

酚氯仿抽提原理

酚氯仿抽提原理
酚氯仿抽提原理是一种常见的有机物提取方法，该方法通过酚氯仿与样品中的目标化合物发生化学反应，将目标化合物从样品中分离出来。

下面将详细介绍酚氯仿抽提原理：
1.溶剂选择：酚氯仿是一种有机溶剂，对许多有机物具有良好
的溶解能力，因此在酚氯仿抽提过程中常常选择酚氯仿作为抽提溶剂。

2.抽提原理：酚氯仿可以与目标化合物发生亲油性反应，形成
可溶于酚氯仿的复合物，并从样品中抽提出来。

这是因为酚氯仿的化学性质使其能够与许多有机物形成相互作用，例如氢键、氧化还原反应等。

3.抽提条件：酚氯仿抽提的条件包括温度、pH值、搅拌速度等。

适当的条件可以促进酚氯仿与目标化合物的反应，并提高抽提效果。

4.抽提步骤：酚氯仿抽提的步骤通常包括样品制备、酚氯仿溶
液制备、抽提过程和目标化合物的分离。

其中，在样品制备过程中需要将样品研磨或者加入适当的溶剂溶解，以便更好地与酚氯仿反应。

5.分离纯化：一般情况下，酚氯仿抽提得到的溶液中还包含有
一些杂质。

为了得到纯净的目标化合物，需要进行进一步的分离纯化步骤，例如溶剂挥发、晶体生长等。

总之，酚氯仿抽提原理通过酚氯仿与目标化合物的化学反应来分离目标化合物。

通过优化溶剂的选择、抽提条件的控制以及后续的分离纯化步骤，可以得到纯净的目标化合物。

酚氯仿法提取DNA原理及方法

酚氯仿法提取DNA原理及方法酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，其原理是利用酚氯仿溶液对细胞和细胞碎片进行破碎，然后通过离心分离DNA。

以下是详细的步骤：1.细胞裂解：将待提取DNA的样本（细胞、组织等）加入含有酚氯仿的裂解缓冲液中，将溶液均匀混合。

酚氯仿是一种有机溶剂，能够破坏细胞膜和核膜，使细胞释放出DNA。

2.蛋白质沉淀：加入混合溶液中的蛋白质会和酚氯仿相互分离，形成一个物理屏障。

离心沉淀后，由于DNA密度比蛋白质低，DNA会上浮到上层，而蛋白质则沉淀在下层。

3.DNA沉淀：将上层液体转移到新的离心管中，加入同等体积的冷乙醇或异丙醇，然后轻轻振荡以促使DNA沉淀。

酒精能够与DNA相互作用，使DNA分子变得更加疏水，从而沉淀下来。

4.清洗：离心沉淀后，将上清液倒掉，加入70%乙醇洗涤沉淀。

乙醇通过去除残留的酚氯仿和其他杂质，使沉淀的DNA纯化。

5. 溶解：将洗涤后的DNA沉淀干燥或用适量的缓冲液溶解，最常用的是TE缓冲液（含有10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA），以便后续的DNA浓度测定和实验操作。

总结来说，酚氯仿法利用酚氯仿溶液破坏细胞膜和核膜，将DNA从细胞中释放出来。

离心分离蛋白质和DNA，然后通过酒精沉淀和乙醇洗涤纯化提取的DNA。

这种方法简单快速，并且能够获得较纯的DNA样品。

不过，酚氯仿法在提取DNA时会同时提取到RNA和蛋白质，因此在一些需要高纯度DNA的实验中可能不适用。

在使用酚氯仿法提取DNA时，还需要注意避免DNA的降解，避免污染和交叉污染，以及正确保存提取的DNA样品。

酚氯仿抽提

酚氯仿抽提一、DNA抽提试剂：1.酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）；2.3M NaAc（pH 5.2）；3.80%乙醇。

步骤：1. 样品加去离子水至总体积100 μL；2．加入100 μl已配好的酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），充分震荡后，10,000 rpm离心10 min；3. 转移上清于新的离心管中，按体积的1/10加入3M NaAc（pH5.2），按体积的2倍加入100%乙醇，轻轻混匀后，-20 ︒C静至至少30 min沉淀DNA；4. 4 ˚C，12,000 rpm离心10 min，弃去上清；5. 1 mL的80%乙醇洗沉淀，10,000 rpm离心2 min；6. 弃去乙醇，风干后，加入适量去离子水或TE溶解质粒。

二、RNA抽提试剂：1.水饱和酚；2.氯仿；3.3M NaAc（pH 5.2，DEPC水配制）；4.75%乙醇（DEPC水配制）。

步骤：1. 加入DEPC水至总体积为100 μL；2. 加入水饱和酚/氯仿(1:1)，室温混匀；3. 4°C, 12, 000 rpm, 15 min；转移上清至新的离心管中；4. 加入等体积的氯仿，4 ︒C, 12, 000 rpm, 15 min, 取上清；5. 加入上清体积1/10的3M NaAc（pH5.2, DEPC水配制）和2.5倍体积的100%的乙醇，-80 ︒C沉淀过夜；6. 4 ︒C离心，12, 000 rpm, 30 min；7. 去上清，加入100 μL 75%乙醇(DEPC水配制)，洗涤沉淀；8. 12, 000 rpm 离心5 min，去乙醇；风干，溶于适量DEPC水中，-20 ︒C保存。

酚氯仿异丙醇抽提核酸的一些问题

酚：氯仿：异丙醇抽提核酸的一些问题2014-01-4 23:191.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。

异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。

有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。

在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在溶液中，从而可达到去多糖的作用。

但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。

缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。

沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。

在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。

需在-20放置很长时间，30分钟-1小时。

同样需要70%乙醇洗涤。

2.一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，3.本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质步骤：质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于20～40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。

酚氯仿抽提dna原理

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿（Phenol-Chloroform）抽提DNA是一种常用的DNA 提取方法。

其原理是基于酚在酸性条件下具有与DNA高度亲和性的特点，可以将DNA从细胞溶液中抽提出来。

具体的步骤如下：
1. 细胞溶解：首先将待提取DNA的细胞样品加入适量的细胞裂解缓冲液中，通过机械或化学方法使细胞壁破裂，释放出细胞内的DNA。

2. 酚抽提：加入相同体积的酚溶液，并进行充分混合。

酚能与DNA形成复合物，并与其他细胞组分（如蛋白质和脂质）发生分层，形成一个DNA上层和一个下层。

3. 脱水：将抽提产物转移至新管中，加入酒精或异丙醇，通过离心将DNA沉淀下来。

脱水过程可以去除溶液中的多余酚，提高DNA沉淀的纯度。

4. 酯化：将DNA沉淀物溶解在适量的TE缓冲液（含有EDTA和Tris）中，经过一定的时间酯化，使DNA变得更为稳定。

5. 沉淀：通过低温离心将DNA沉淀下来，去除上清液。

6. 洗涤：用70%的乙醇洗涤并去除残余的盐、酚和脏物质。

洗涤过程中，可以多次进行离心和上清液倒掉操作。

7. 干燥：最后，将DNA输送液置于干燥器中或者自然风干，以去除溶剂中的残留物质，得到纯度较高的DNA。

通过酚氯仿抽提DNA的方法，可以从复杂的细胞中提取出高质量、高纯度的DNA，以供后续分子生物学研究使用。

基因组DNA的提取方法—酚

基因组DNA的提取方法—酚-氯仿抽提法1. 将95% 酒精浸泡过的标本取出，用吸水纸吸去标本表面的乙醇，用1×TE Buffer浸泡两次，每次20min。

2. 解剖取个体胸部肌肉组织约0.02g，将组织转入1.5mL离心管加入1mL液氮使其迅速冻结, 用玻璃棒迅速有力地将团状组织研磨成细粉末。

3. 加入500uL消化液（消化液成分为NaCl 0.1mol/L, Tris-HCl 0.3mol/L, EDTA 0.01mol/L, SDS 1%, Proteimase K 200ug/mL），于56℃恒稳水浴中消化8-10小时, 每隔两小时摇晃一次。

4. 消化结束后，加入等体积的饱和酚（pH7.6），用封口胶封好，置于混匀器上约12小时，离心10分钟（10000r/m）。

5. 取上清液于另一新的EP管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），缓慢抽提20分钟，离心10分钟（10000r/m）。

6. 取上清液于另一新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），缓慢抽提20分钟，离心10分钟（10000r/m）。

7. 取上清液于另一新的EP管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃放置2小时。

8. 离心后，DNA沉积于管底，用70%的预冷的乙醇洗涤2次，37℃烘干。

烘干的DNA溶于TE中，4℃保存。

9. 于基因组DNA中加入终浓度为50ug/mL的RNase（每次使用前90℃灭活10min），于37℃消化1.0-1.5hr。

10. 用0.8%的琼脂糖凝胶检测，取3μL DNA样品及2μL Load-buffer (含溴酚蓝和缓冲液)，加入点样孔。

实验所用Marker是 DNA（EcoR/HindIII），100V电压电泳90分钟。

凝胶成象分析仪进行检测。

11. 用紫外可见分光光度计测定DNA的OD值，判定DNA纯度和浓度。

常规酚-氯仿抽提法改进

常规酚-氯仿抽提法改进.
取材：取50 mg 肌肉组织放入1.5 mL Ep管中，加灭菌双蒸水，用灼烧过的剪刀将肌肉剪碎（越碎越好）.
消化：吸除Eppendorf 管中的双蒸水，加入500 μL裂解缓冲液及6～7 μL 的20 g/L 的蛋白酶K，置于55 ℃水浴锅中消化. 在消化的第1 h 内，每隔10 min 混匀1次，加快消化速度. 消化时间根据消化程度而定，大约3～4 h.
Tris-平衡酚抽提：4 ℃、5 000 r/min 条件下，将消化后的组织液离心5 min，取上清液至新的Eppendorf 管中，加入等体积的Tris-平衡酚（约500 μL），旋转器上摇匀10 min，在4 ℃、8 000 r/min 条件下离心15 min，上清液移至新的Eppendorf 管中.
混合抽提：加入Tris-平衡酚和氯仿异戊醇混合液各250 μL，颠倒混匀10 min，在4 ℃、8 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液至新的Eppendorf 管中.
氯仿异戊醇抽提：加入等体积的氯仿异戊醇，颠倒混匀10 min，4 ℃、8 000 r/min 条件下离心15 min. 将上层水相小心转移至新的Eppendorf 管中.
沉淀：加入4 ℃、0.1 倍体积浓度为3 mol/L 的NaAc（约50 μL）、2.5 倍体积冷冻的无水乙醇（约1 mL），旋转混匀. 置于-20 ℃冰箱，沉淀3 h 以上.
保存：在4 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min 后弃掉溶液，烘干，加入50μL 灭菌双蒸水在4℃冰箱保存.。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

常用核酸提取技术介绍

常用核酸提取技术介绍核酸提取是从细胞或组织中分离纯化核酸的过程。

核酸提取技术广泛应用于生命科学研究中，例如基因测序、PCR扩增、基因克隆、基因组学研究等。

下面将介绍几种常用的核酸提取技术。

1.酚-氯仿法酚-氯仿法是一种经典的核酸提取方法。

该方法主要包括细胞破碎、蛋白质消化和核酸沉淀三个步骤。

首先，细胞经过机械强化破碎，释放出核酸。

接着，通过酚的提取使蛋白质溶解，然后利用氯仿分离出水相中的核酸沉淀。

最后，通过酒精沉淀获得纯化的核酸。

优点是操作简单，适用于各种样品类型。

缺点是提取的核酸可能含有蛋白质、多糖等杂质，纯度较低。

2.磁珠法磁珠法是一种高效的核酸提取方法。

该方法利用特定的磁性珠子将核酸选择性地吸附，然后通过磁力将珠子与非目标杂质分离。

该方法相对于传统的酚-氯仿法具有许多优点，包括提取纯度高、自动化程度高、适用于大规模样品处理等。

磁珠法特别适用于高通量的核酸提取和高通量测序等需求。

3.硅胶柱法硅胶柱法是一种常用的核酸提取方法。

该方法利用硅胶膜的亲和性，将核酸吸附到硅胶膜上，然后通过洗涤和洗脱步骤来纯化核酸。

硅胶柱法适用于从小规模样品中提取纯度较高的核酸，例如从血液、组织和细菌培养物中提取DNA。

硅胶柱法提取的核酸能够进行各种分子生物学和分子诊断应用。

4.针对特定样品的提取方法不同类型的样品可能具有不同的特性和组分，因此需要针对特定样品开发相应的核酸提取方法。

例如，提取环境样品中的核酸可能需要经过过滤、浓缩、去除抑制物等步骤。

提取血液样品中的核酸可能需要应用抗凝剂来避免核酸降解。

提取植物样品中的核酸可能需要使用纤维素酶来消化细胞壁。

因此，在选择和设计核酸提取方法时，应该考虑到样品的特点和需求。

总之，核酸提取是生命科学中基础而重要的步骤，良好的核酸提取方法可以确保提取纯度高、完整的核酸样品，为后续的基因分析提供可靠的基础。

不同的核酸提取方法各有优缺点，根据实验需求和样品特点选择合适的方法是至关重要的。

三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。

定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1> SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。

其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。

因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。

SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。

PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。

SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。

这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。

<2> 水解探针模式<taq man探针>TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。

当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。

一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。

随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。

因此Taqman 探针检测的是积累荧光。

PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。

酚氯仿抽提dna原理

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿抽提DNA原理是一种常用的DNA提取方法，通过该
方法可以从复杂的生物样品中高效地提取纯度较高的DNA样本。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞破碎：首先将待提取的生物样品经过离心等操作，去除无关细胞和组织，然后使用细胞裂解缓冲液将目标细胞破碎，使细胞内部的DNA释放出来。

2. 蛋白酶处理：在细胞裂解的过程中，蛋白酶会释放出来，为了去除其对DNA的影响，可以加入蛋白酶抑制剂来保护DNA。

此步骤的目的是降解蛋白质，同时保持DNA的完整性。

3. 混合酚氯仿：将细胞裂解液与等体积的氯仿混合，产生两相体系。

氯仿主要用来分离DNA和其他细胞成分，如脂质、蛋
白质等。

在混合过程中，DNA溶于水相，而其他成分溶于有
机相。

这样，通过离心使两相分离。

DNA会聚集在水相中。

4. DNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，加入冷酒精或异
丙醇，使DNA沉淀出来。

酒精或异丙醇中的离子会中和
DNA上的电荷，从而使DNA不溶于水，形成可见的白色沉淀。

5. 洗涤与溶解：将DNA沉淀用无菌蒸馏水洗涤去除酒精或异
丙醇的残余，并用TE缓冲液溶解DNA，使其得以储存和进
一步应用。

通过酚氯仿抽提DNA，可以将DNA从细胞中高效地提取出
来，纯度较高，适用于许多分子生物学实验和技术的应用，如PCR、酶切、测序等。

酚氯仿法提取dna注意事项 -回复

酚氯仿法提取dna注意事项-回复酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，适用于从多种生物样本中提取高质量的DNA，具有操作简便、成本低廉、提取效果好的优点。

然而，在进行酚氯仿法提取DNA时，有一些注意事项需要遵守，以确保提取到的DNA质量和纯度满足实验要求。

本文将一步一步回答有关这一主题的问题。

第一步：准备实验材料在进行酚氯仿法提取DNA之前，需要准备好以下实验材料:- 酚氯仿：用于沉淀DNA，可以购买现成的酚氯仿溶液。

- 氯仿：用于去除蛋白质等杂质。

- 去离子水：用于配制实验缓冲液和洗涤试剂。

- 各种缓冲液：例如Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液等，用于维持溶液的pH 值、维持DNA的稳定性等。

- 乙醇、异丙醇：用于洗涤、沉淀DNA等步骤。

- 高速离心管、离心机：用于离心沉淀DNA。

- 热板：用于DNA溶解步骤中的加热。

- 显微镜：用于观察DNA的溶解情况。

第二步：取样从待提取DNA的生物样本中取样时，需要注意以下几点:- 样本应选择新鲜的、含有丰富DNA的组织或细胞。

- 取样时应尽量避免污染，使用无菌工具，避免有外源DNA的干扰。

第三步：细胞破碎将取得的样本放入离心管中，加入破碎液并充分混匀。

常用的细胞破碎液包括含有洗涤剂（例如SDS或Triton X-100）和蛋白酶K的缓冲液。

注意事项如下：- 破碎液应加入足够量，以确保细胞完全破裂。

- 破碎液的温度和pH值应适宜，通常为室温和中性pH值。

第四步：离心将混合后的细胞溶液进行离心，去除细胞碎片和细胞核。

注意事项如下：- 离心条件应根据细胞大小和沉淀速度进行调整，通常为1,200-2,000 rpm，5-10分钟。

- 应尽量避免将上清液中的沉淀物和底物混合。

第五步：提取DNA将上清液转移到新的离心管中，加入酚氯仿并混合。

注意事项如下：- 酚氯仿的添加量应为样本体积的1/5-1/10，用于沉淀DNA。

- 混合时应充分摇匀，以便酚氯仿与上清液充分接触。

酚氯仿法提取DNA的原理

酚氯仿法提取DNA的原理酚氯仿法是一种用于提取DNA的常见方法，它基于DNA与酚氯仿在两相溶液中由于密度差异而发生分离的原理。

下面将详细介绍酚氯仿法提取DNA的原理及步骤。

DNA是一个带有负电荷的双链分子，其溶解度与其环境的离子力有关。

酚氯仿可以形成无水酚、蛋白质和DNA、RNA在其中既不溶于水又不溶于酚氯仿的界面。

当DNA溶液与酚氯仿混合时，DNA会从水相转移到有机相（酚氯仿相）中，实现分离。

1.细胞裂解：将待提取DNA的细胞加入缓冲液中，并通过机械、热力或化学方法使细胞裂解，释放DNA。

2.去除蛋白质：加入蛋白酶K等蛋白酶使蛋白质降解，形成胶冻样物质。

3.DNA溶解：加入盐酸溶解胶冻样物质，使DNA溶于溶液中。

4.全球胆碱设备实验室的志愿者在2024年完成了其中一个针对雌激素和其他抗生素的研究试验。

5.沉淀DNA：加入冰冷的异丙醇或乙醇，在DNA溶液中形成DNA沉淀。

6.制备DNA：将DNA沉淀转移到新的管中，并用乙醇洗涤去除杂质。

7.定量和存储：使用分光光度计测量DNA的浓度，然后将其保存在适当的条件下，以便后续实验中使用。

1.方法成本较低，步骤简单易行。

2.可以提取高纯度的DNA。

3.可以在较短时间内提取大量DNA。

1.操作要注意安全，避免酚氯仿的接触和吸入。

2.使用无菌技术和无菌材料，以避免外源性DNA的污染。

3.避免DNA溶液的过热和过长的暴露于空气中，以避免降解DNA。

总结：酚氯仿法提取DNA是一种常用的DNA提取方法，其原理是通过DNA与酚氯仿在两相溶液中的密度差异实现DNA的分离。

该方法简单易行，可以提取高纯度的DNA，适用于很多生物学实验和研究领域。

在进行实验时，需注意操作安全和避免DNA污染，以保证提取到高质量的DNA。

用于从样本中提取核酸的方法和试剂盒与流程

核酸提取是分子生物学研究中非常重要的步骤，其影响着后续实验的结果。

目前，有许多不同的方法和试剂盒可以用于从样本中提取核酸，但每种方法都有其优缺点。

本文将介绍常见的核酸提取方法和试剂盒，并详细说明其使用流程。

希望能帮助读者更好地理解核酸提取的原理和操作步骤。

一、常见的核酸提取方法1.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是最经典的核酸提取方法之一。

其原理是利用酚和氯仿两种有机溶剂与水相不相溶的特性，将核酸从样本中分离出来。

虽然酚-氯仿提取法具有成本低、操作简单等优点，但由于酚和氯仿均具有毒性，对实验人员的健康造成潜在风险，且提取效率较低。

2.硅基离子交换法硅基离子交换法是一种通过硅胶基质固相吸附核酸分离纯化的方法。

其原理是利用硅胶质地的吸附能力，将核酸固定在硅胶表面，然后通过洗涤和洗脱的方式得到纯化的核酸。

硅基离子交换法具有提取效率高、纯度好等优点，但需要使用硅基离子交换柱和大量有机溶剂，成本较高。

3.磁珠法磁珠法是近年来发展起来的一种核酸提取方法，其原理是将在不同条件下具有不同亲和性的磁珠与核酸结合，然后通过磁力分离的方式将核酸提取出来。

磁珠法具有操作简便、提取效率高、易于自动化等优点，目前被广泛应用于临床诊断和科研领域。

二、常见的核酸提取试剂盒1.常规核酸提取试剂盒常规核酸提取试剂盒是市面上最常见的一种提取试剂盒，适用于各种类型的样本。

其操作流程一般包括细胞破碎、蛋白酶处理、核酸结合、洗脱等步骤，提供了一整套的实验操作说明。

常规核酸提取试剂盒通常包括硅基离子交换柱、试剂液、配套的离心管等。

2.血浆/血清核酸提取试剂盒血浆/血清核酸提取试剂盒是专门用于提取血浆或血清中的核酸的试剂盒。

由于血浆/血清中的核酸含量较低，且受到抗凝剂和其他成分的干扰，因此需要专门设计的提取试剂盒。

血浆/血清核酸提取试剂盒一般包括了特殊的蛋白酶和离心管。

3.病毒核酸提取试剂盒病毒核酸提取试剂盒是专门用于提取病毒中的核酸的试剂盒，适用于临床病毒检测和科研领域。

一种提高组织DNA抽提得率的方法

一种提高组织DNA抽提得率的方法【摘要】目的采用常规酚-氯仿抽提法方法提取组织DNA，通过延长水浴时间提高提取DNA得率。

方法各组设置不同的水浴时间，比较所提DNA得率。

结果用酚-氯仿提取肝脏DNA，随着水浴时间的延长（2.5～7.5h），DNA提取得率由每100mg肝脏组织中得到341.4μg提高到701.9μg。

结论该方法适用于用酚-氯仿对少量组织需提取较大量DNA的实验，为下一步的实验研究做准备。

【关键词】酚-氯仿;DNA得率基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。

酚-氯仿提取组织DNA的方法从上个世纪八十年代开始应用，以其操作简便，效果好而一直方兴未艾。

本实验旨在对酚-氯仿提取组织基因组DNA的过程加以改进，从少量组织中提取较大量DNA，用于下一步实验研究［1］。

1 材料与方法1.1 材料每个样本取SD大鼠肝脏0.1g，共做24个样本，以8个样本为一组，每组水浴时间不同，Ⅰ组水浴2.5h；Ⅱ组水浴5h；Ⅲ组水浴7.5h。

1.2 主要试剂细胞裂解液：30mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，0.1 mM NaCl，pH 8.0；10mg/ml蛋白酶K、SDS、饱和酚、氯仿、异戊醇、无水酒精、1mol/L TE缓冲液。

1.3 方法1.3.1 酚-氯仿提取组织基因组DNA［2］ (1)取100mg肝脏加1ml细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆；(2)匀浆液倒入2ml塑料离心管中，加20μl蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀；(3)混合液置于55℃水浴，水浴时间分别为Ⅰ组2.5h、Ⅱ组5h、Ⅲ 组7.5h；(4)水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min；(5)吸上层水相800μl于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5 min；(6)吸上层水相500μl于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h或液氮中放置5min；(7)12000g离心5min，沉淀DNA，倾去上清液；(8)于沉淀中加入75%乙醇溶液500μl，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干；(9)向DNA沉淀中加200μl TE缓冲液，-20℃保存备用。

苯酚氯仿抽提的技术原理

苯酚氯仿抽提的技术原理
使用氯仿从苯酚溶液中抽提的技术原理可以概括为:
1. 苯酚与氯仿的相对溶解度
苯酚易溶于氯仿而难溶于水,氯仿与水基本不混溶。

2. 抽提过程
将苯酚的水溶液与氯仿混合,搅拌使苯酚转移至氯仿相中。

3. 两相分离
静置后上层为氯仿相,含有苯酚;下层为水相。

根据相对密度分离收集上氯仿相。

4. 回流提纯
可以通过多次氯仿回流提纯,进一步提高苯酚纯度。

5. 除水干燥
使用无水硫酸钠等干燥剂除去氯仿相中的残留水分。

6. 蒸馏浓缩
简单蒸馏可以回收氯仿;减压蒸馏可浓缩提纯苯酚。

7. 萃取机械提高效率
采用连续萃取设备,可以提高抽提效率。

8. 溶剂回收
通过蒸馏、萃取等方式回收氯仿溶剂,实现循环利用。

9. 过程参数控制
控制好溶液pH、温度、流量等参数,可以提高提取效果。

10. 环保处理
对废溶剂、废水等要进行处理,减少污染。

综上,该技术利用溶解度差异实现苯酚的溶剂萃取和提纯。

乙醇,异戊醇,酚。氯仿,提取DNA

酚：氯仿：异丙醇抽提核酸的一些问题2011-01-23 23:191.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。

异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。

有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。

异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。

但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

异丙醇：优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。