海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究
产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究【开题报告】
开题报告生物科学产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义舟山地处长江口南侧，地理位置介于东经121°30′～123°25′，北纬29°32′～31°04′之间，地理环境优越，生物资源丰富。
特别是舟山海域潮间带，所谓潮间带，即是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位间的海岸，也就是海水涨至最高时所淹没的地方开始至潮水退到最低时露出水面的范围。
由于潮间带的特殊性质使得潮间带微生物环境中生长的放线菌就会具有非常独特的生理生化性质，可能在它们身上发现一些具有特殊作用的代谢产物。
海洋微生物包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌等，是一个正在开发的重要生物资源。
海洋环境独特，具有高压、高盐、低营养、低温的特点。
在这种环境中海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上，代谢途径不同于陆地微生物，因此，可以产生多种新的物质。
目前各国已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物中分离到多种活性物质，这些活性物质可大致分为：1、抗生素：研究表明海洋微生物及其代谢产物是寻找新抗生素的重要来源。
其中海洋放线菌始终是研究和开发的前沿。
头孢菌素C、P、N，硫酸小诺霉素就是由海洋放线菌分泌产生并已得到临床应用的抗生素[1]。
2、抗肿瘤活性物质：海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，国内外已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物体内分离到多种抗肿瘤活性物质[2]。
3、毒素：海洋生物毒素一直是海洋活性物质研究的焦点之一。
目前发现，许多海洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋生物上的海洋微生物所产生。
其中研究较多的是河豚毒素(TXX)。
4、酶制剂：由海洋微生物生产的酶制剂，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。
其中包括蛋白酶，淀粉酶，热稳定酶等等。
淀粉酶(amylase) 是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。
它广泛存在于动植物和微生物中。
海洋放线菌及其生物活性的研究
海洋放线菌及其生物活性的研究唐婧媛薛永常唐婧媛，大连工业大学生物工程学院，116034，大连市甘井子区轻工苑1号。
薛永常(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2010-08-17放线菌（actinomycetes ）是一类具有分枝状菌丝体的高（G+C ）%/mol 的革兰氏阳性菌，因早期发现其类群的菌落呈放射状而得名。
放线菌广泛存在于不同的自然生态环境中，种类繁多、代谢功能各异，其特有形态和生物学特性是研究生物形态发育和分化的良好材料；许多放线菌能产生生物活性物质，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源[1]。
目前分离得到的放线菌绝大多数来源于土壤，陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的70%以上。
但陆生放线菌中能分离出的先导化合物数量毕竟有限，近20年来人们把目光投向了海洋[2]。
海洋占地表面积的71%，海洋生物物种比陆地生物丰富和复杂，生活环境比陆地生物迥异，因此，具有一些特殊的结构和功能，以维持其生命活动。
海洋放线菌因其生活的高盐、高压、低温与低营养等特殊环境而产生其独特的代谢方式，这既确保了在极端环境中生存，也提供了产生抗生素的潜力。
海洋放线菌是新药开发和天然活性产物的重要来源,海洋放线菌的生物多样性是代谢产物功能多样性的基础,因此，研究可培养放线菌的生物多样性具有重要的意义。
1海洋放线菌的多样性海洋环境特殊多样，赋予海洋中的放线菌种类繁多，常见的包括诺卡菌属(Nocardia)、链霉菌属(Streptomycetes)、小单孢菌属(Micromonospora)、放线菌属(Actinoplanetes)等[3]。
据报道可分离到的海洋放线菌近乎分布于海洋各个角落，包括海水、海泥、海底沉积物、海洋动植物等。
Han 等（2003）从东海Amursky海湾的海水中分离得到3株海洋放线菌，其中一株经鉴定属于新分离的一个属，Salinibacterium 属，具有耐盐的作用[4]。
海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究
海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究补体系统是人体非常重要的免疫防御系统之一,其在消除微生物入侵和维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。
但是,补体系统如果过度激活会引起类风湿性关节炎、老年性痴呆及急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。
天然产物来源的抗补体活性成分具有可持续生产,且能在体内被直接消化吸收等优点因此引起了国内外学者广泛的关注。
由于微生物易于培养、易于基因工程改良,且微生物来源的产品质量容易控制,所以微生物来源的抗补体活性物质具有良好的应用前景。
然而,目前对微生物来源抗补体活性物质的研究还非常有限。
海洋放线菌次级代谢产物复杂多样,且具有众多生物活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒、细胞毒性和抗肿瘤活性,因此海洋放线菌已成为新药研究与开发的新来源,但目前对海洋放线菌的抗补体活性物质的研究还处于起步阶段。
本课题首先筛选了具有抗补体活性的海洋来源链霉菌,并对两株产抗补体活性物质的菌株星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674T(简称 S187)和海洋链霉菌Streptomyces sp.DUT11(简称DUT11)进行了深入研究,得到以下主要结果:(1)对分离自大连星海湾和小平岛海平面以下约10m处的海泥样品中的42株海洋放线菌进行了抗补体活性物质生产菌筛选,发现7株海洋放线菌的发酵液具有良好的抗补体活性。
对这7株放线菌进行了 16S rRNA基因序列分析,发现这些海洋放线菌分别属于不同的种,提示可产生抗补体活性物质的海洋放线菌菌株有丰富的生物多样性。
(2)进一步研究了具有良好抗补体活性的菌株星海链霉菌S187抗补体活性物质的生产,对其抗补体活性次级代谢产物的发酵培养基进行优化,并对抗补体活性物质进行了分离纯化和结构解析。
首先,选取7种不同培养基对菌株S187进行了发酵条件优化,确定M12培养基为最佳培养基,并对其发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件为:初始pH为7.0,温度为28 ℃,培养时间为6天。
海洋新放线菌及其次级代谢产物研究进展
海洋新放线菌及其次级代谢产物研究进展【摘要】由于自身特殊的生存环境，海洋放线菌具有复杂独特的代谢途径，产生了诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，这些活性代谢产物为新抗生素的发现提供了丰富的先导化合物，有些已经进入临床前研究。
本文简要介绍近十几年从海洋样品中分离到的放线菌新种属及其次级代谢产物研究概况。
【关键词】海洋放线菌；代谢产物； Salinispora； Verrucosispora；MarinisporaABSTRACT Due to the special living environment， marine-derived actinomycetes possess distinct and complex metabolic capabilities，resulting in wide persity of their secondary metabolites in chemical structure and biological activity. Among them， many valuable leading compounds were obtained for discovery of new antibiotics， and some had been selected for preclinical study. The research advances in discovery of new actinomycetes and their secondary metabolites were briefly reviewed in this paper.KEY WORDS Marine-derivedactinomycetes;Metabolites;Salinispora;Verrucosispora;Marinispora放线菌是一类高(G+C)%的革兰阳性细菌，与人类关系密切。
海洋抗菌活性物质
1889年De Giaxa首次报道了海水中存在有潜在的抑制炭疽、霍乱病 原菌的细菌。过了近60年后，Rosenfeld 和 Zobell描述了一些海洋细 菌可产生抗生素. 后来Krassil ni kova和Buck的工作进一步确证了海 洋细菌的抗菌作用，其中Buck的研究表海洋细菌对酵母有抑制作用. Burkholder 等从海洋含溴假单胞菌(Pseudomonas bromoutilis)中 分离到抗生素硝吡咯菌素pyrolnitrin(1), 掀开了海洋微生物活性物质 研究的序幕, 随后有多种海洋微生物所产生的抗生素被发现。 Isnansetyo和Kamei从海洋细菌Pseudoalteromonasphenolica sp. nov. 中得到1个新的抗生素 MC21-A(2), 该化合物对耐青霉素的葡萄球 菌有杀菌作用, 其作用效果与万古霉素相当, 但是作用机制与万古霉素 不同,MC21-A主要是通过透化细菌细胞膜来发挥作用的。 Choi等从韩国济州岛潮间带的海泥中分离到一株海洋细菌Hahella chejuensis, 运用多种色谱分析的方法从乙酸乙酯提取物中得到2个新 的17环的大环五烯化合物chejuenolides A 和 B(3, 4)。研究表明, 这 2种大环五烯化合物具有抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌的抗菌活性, 同时他们对蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)表现出较弱 的抑制作用, 在浓度为150 μg· mL−1时的抑制活性在65%-75%。PTP1B 的 抑制剂被认为是治疗Ⅱ型糖尿病及其相关的代谢综合症的一种很有潜力 的化合物。
抗菌活性物质主要包括抗细菌、抗真菌抗病毒物质三 类，其中主要以抗细菌活性物质为主。已报道的海洋抗菌活 性物质主要来源于海洋放线菌、海洋细菌、海洋真菌及海洋 微藻等。 一、海洋放线菌 二、海洋细菌 三、海洋真菌 四、海洋微藻
海洋放线菌的分类鉴定
海洋放线菌的分类鉴定一、放线菌㈠、放线菌的分布放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。
不论数量和种类，以土壤中最多。
河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。
海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。
海水中还存在耐盐放线菌。
放线菌有一种土霉味，使水和食物变味，有的放线菌也能和霉菌一样使棉毛制品或纸张霉变。
放线菌主要能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂，最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，可导致人类的结核病和麻风病。
放线菌最重要的作用是可以产生、提炼抗生素，目前世界上已经发现的2000多中抗生素中，大约有56%是由放线菌（主要是放线菌属）产生的，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素等都是由放线菌产生的。
此外有些植物用的农用抗生素和维生素等也是由放线菌中提炼的。
㈡、放线菌的形态与结构放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。
放线菌是一种革兰氏阳性菌。
放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。
⑴营养菌丝匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。
营养菌丝一般无隔膜；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。
色素是鉴定菌种的重要依据。
⑵气生菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。
它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。
在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。
直形或弯曲而分枝，有的产生色素。
⑶孢子丝气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝。
孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。
孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形。
放线菌4-1的鉴定及其发酵液抑菌作用和稳定性探究
放线菌4-1的鉴定及其发酵液抑菌作用和稳定性探究
郭宇豪;刘绍波;葛菁萍;平文祥
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2024(40)9
【摘要】旨在挖掘盐碱地菌种资源并对其抑菌功能进行检测。
以自行分离的放线菌4-1为候选菌株,利用形态学、生理生化以及分子生物学手段对其种属地位进行综合鉴定;采用琼脂扩散法和菌丝生长速率抑制法对其发酵液抑菌活性和稳定性进行评价。
结果表明,菌株4-1与紫赤链霉菌(Streptomyces puniceus)最为相似,同源性高达99.93%,建立的系统发育树中二者亲缘关系最为相近;菌株4-1发酵液的抑菌谱比较广泛,对病原性细菌(6株)和病原性真菌(5株)都具有一定的抑制效果;酸碱、热、紫外线对发酵液稳定性影响较小,但当温度高于90℃或pH<4时,发酵液抑菌活性下降。
该菌种资源的获得及功能评价,为进一步扩大根际促生细菌种类及应用奠定了菌种基础。
【总页数】7页(P117-123)
【作者】郭宇豪;刘绍波;葛菁萍;平文祥
【作者单位】黑龙江大学;河北环境工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】S182
【相关文献】
1.抗真菌土壤放线菌的筛选鉴定、发酵培养基优化及发酵液稳定性研究
2.放线菌AF1发酵液提取物对病原微生物的抑菌作用和稳定性分析
3.抑菌放线菌筛选鉴定及其发酵条件和发酵产物稳定性的研究
4.海南省土壤拮抗放线菌的分离筛选及发酵液抑菌作用测定
5.放线菌菌株97发酵液中活性代谢产物的抑菌作用及稳定性测定
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海洋放线菌研究的新进展
海洋放线菌研究的新进展首先，通过海洋放线菌的筛选和分离，研究人员已鉴定出许多新的海洋放线菌菌株。
这些菌株来自不同的海洋环境，如海水、海底地球化学活动区域等。
这些新菌株具有丰富的多样性和生物活性，为进一步研究海洋放线菌的化学成分和生物学活性提供了重要的资源。
其次，对海洋放线菌代谢产物的研究已取得了突破。
研究人员通过分离、纯化和鉴定，发现了一系列新的海洋放线菌代谢产物。
这些化合物包括抗生素、抗肿瘤药物、抗炎药物等。
例如，一项研究报道了一株从海洋中分离的放线菌菌株产生的新化合物，具有良好的抗肿瘤活性。
这些新的代谢产物显示出潜在的临床应用前景，为新药开发提供了新的方向。
此外，对海洋放线菌生物合成途径的研究也取得了进展。
研究人员通过分析放线菌基因组和转录组数据，揭示了许多海洋放线菌的次级代谢基因簇。
这些基因簇编码着合成特定代谢产物的酶和调控蛋白。
通过进一步的研究，研究人员已成功地利用基因工程和生物合成技术，改造和调节放线菌的生物合成途径，增强目标代谢产物的产量和多样性。
这将有助于加速新药物的发现和生产。
最后，随着对海洋环境的深入了解，研究人员对海洋放线菌的生态学角色也表现出兴趣。
他们发现，海洋放线菌在海洋生态系统中起着重要作用，例如参与有机物的降解和循环。
此外，海洋放线菌还与其他生物形成复杂的共生关系，如共生海绵。
这些共生关系对于海洋生态系统的稳定和功能具有重要意义。
综上所述，海洋放线菌研究在近年来取得了新进展。
通过对新的菌株的筛选和分离、海洋放线菌代谢产物的研究、生物合成途径的解析以及生态学角色的探索，我们对海洋放线菌的了解更加全面。
这将为新药物的发现和海洋生态系统的保护提供重要的科学依据。
XS904菌株发酵条件的优化及其杀虫活性物质的理化特性
浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis18(6):441～444,2006XS904菌株发酵条件的优化及其杀虫活性物质的理化特性孙爱飞1,杨文鸽1,潘云娣2,楼乔明1,童丽娟1(1宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波315211;2厦门出入境检验检疫局,福建厦门361012)摘 要:从浙江象山港海涂泥样中分离的海洋放线菌XS904菌株发酵液具有较强的杀虫活性。
文章以XS904菌株发酵提取物的杀虫活性为指标,对该菌株的发酵条件如培养基装量、培养基初始pH值、发酵温度及发酵时间等进行优化,同时对具有杀虫活性的发酵产物的部分理化性质进行研究。
结果表明:利用黄豆粉培养基液体发酵时,在培养基装量为25ml,初始pH7.5,温度30℃的条件下,XS904菌株通过5d发酵后得到的产物的杀虫活性最高;该杀虫活性成分极性较强,具有较好的pH值稳定性和热稳定性。
利用Diaion HP2MG L大孔吸附树脂柱层析进行初步纯化,杀虫活性物质主要集中于乙醇和水的体积比为4∶6的洗脱液中。
关键词:XS904菌株;杀虫活性;发酵条件;理化特性中图分类号:Q939 文献标识码:A文章编号:1004-1524(2006)06-0441-04Optimum fermentation conditions for insecticidal active substances from XS904strain and its physical and chemical propertiesS UN Ai2fei1,Y ANG Wen2ge1,PAN Y un2di2,LOU Qiao2ming1,T ONGLi2juan1(1Faculty o f Life Science and Biotechnology,Ningbo Univer sity,Ningbo315211,China;2Xiamen Entry2Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xiamen361012,China)Abstract:This paper studied optimum fermentation conditions for insecticidal active substances from XS904strain is olated from sea2mud sam pled from X iangshan port and its physical and chemical properties.The results showed that the active sub2 stances had high insecticidal activity.When the S LM used as cultural medium,the optimal fermentation conditions were as follows:25ml/250ml for medium v olume,initial pH7.5,culturing for5days at30℃.The insecticidal active substances exhibited strong polarity and g ood stability to tem perature and pH.The insecticidal active substances were purified by Diaion HP2MG L macroporous ads orptive resin and concentrated mainly in the elution of40%ethanol s olution.K ey w ords:XS904strain;insecticidal activity;fermentation condition;physical and chemical properties 化学农药往往具有高残留、易产生抗药性、不易分解等特点,长期使用会造成环境污染和生态破坏,危害人类健康。
一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究
一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究放线菌,尤其是链霉菌,作为抗生素的重要来源,一直以来都是天然产物研究的热点之一。
本文以德国北海海水中分离到的一株海洋放线菌为研究对象,通过对其16S r DNA测序鉴定其与链霉菌Streptomyces sp.strainnenu<sub>D</sub>S<sub>2</sub>1有99%的同源性。
本实验将该菌编号为AC1。
通过初期大米培养基发酵,发现其代谢产物种类丰富,且乙酸乙酯及正丁醇萃取部分对水稻纹枯病菌、梨黑斑病菌表现出良好的抑菌活性。
对该菌采用大米发酵以及高氏一号液体培养基发酵,之后用硅胶柱、凝胶柱、C18反相柱以及高效液相色谱柱等色谱分离纯化方法结合薄层色谱分析对其发酵产物进行分离纯化,对分离得到的代谢产物成分采用质谱（MS）以及1D和2D 核磁（1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC）等波谱技术进行结构鉴定,并进行抑菌活性的研究,最终结果如下:（1）从AC1的大米发酵代谢产物中分离出了编号为I-VIII共8个单体化合物。
其中I号化合物为2,3-dihydroxybenzamide,II号化合物为pyramidamycin B,VIII号化合物为flufuran,V、VI、VII号化合物为首次从自然界中分到的酰胺类天然产物,III、IV为新的化合物。
I,II,III,IV,VII号化合物为苯甲酰胺类化合物,V,VI,VIII号化合物为呋喃类化合物。
从高氏一号液体发酵代谢产物当中分到了IX和X两个单体化合物.其中IX号为苯甲酰胺类化合物3-[（3’-amino-3’-oxoprop-1’-en-2’-yl）oxy]benzamide。
X号化合物为新的链型酰胺类化合物。
在分离鉴定的10个化合物当中,VIII 化合物为该菌产生的主要成分。
（2）将分离得到的10个化合物采用滤纸片扩散法对番茄灰霉病菌、苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌5种植物病原真菌以及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种病原细菌作体外抗菌实验,筛选其中具有抗菌活性的成分,其中VIII化合物对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、苹果斑点落叶病菌都具有一定的抑菌活性,V,VI化合物则表现出对枯草芽孢杆菌的抑制活性。
海洋真菌菌种的筛选及其抗菌活性研究
海洋真菌菌种的筛选及其抗菌活性研究在海洋生态系统中，真菌是一类丰富多样的微生物。
它们生存在水体中，也可以从沉积物、植物和动物体表分离出来。
近年来，研究人员对海洋真菌进行了广泛的研究，并发现了它们在抗菌活性等方面的潜力。
本文将介绍海洋真菌菌种的筛选方法，并探讨其抗菌活性的研究。
一、海洋真菌菌种的筛选方法海洋真菌的筛选是首要的步骤，它决定了后续的研究方向和进一步的实验。
以下是一些用于海洋真菌菌种筛选的常用方法：1. 采集海洋样品：海洋样品可以来自各个深度、不同类型的海域，如海洋底栖生物、沉积物、海草、海藻等。
样品采集后需立即进行处理，避免细菌和其他真菌的污染。
2. 分离真菌：将采集的海洋样品进行稀释，然后在适当的培养基上进行分离培养。
通过孢子悬滴法或划线法，得到单菌落的纯培养株。
3. 保存纯培养株：将分离得到的纯培养株保存在液氮中或以其他冻干方法保存，以备后续的实验使用。
4. 分子鉴定：确定真菌属和种的鉴定，可通过16S rRNA或ITS等序列进行分析。
这将为后续实验提供更多的信息。
二、海洋真菌的抗菌活性研究海洋真菌具有多样化的活性化合物，其中包括抗菌活性的物质。
以下是一些用于海洋真菌抗菌活性研究的主要方法：1. 抗菌活性筛选：将分离得到的海洋真菌进行抗菌活性的筛选。
常用的筛选方法包括纸片扩散法、井板法和微量稀释法。
通过与不同类型的细菌或真菌接触，观察抑菌圈的直径或最低抑菌浓度。
2. 提取活性物质：从具有抗菌活性的真菌培养物中提取活性物质。
通常使用有机溶剂如乙醚、甲醇和乙醇进行提取，并通过旋蒸或冷冻离心等方法得到纯化的提取物。
3. 结构鉴定：通过质谱和核磁共振等技术对提取物进行结构鉴定。
这将帮助确定活性物质的种类和结构，为后续的活性机制研究提供依据。
4. 抗菌机制研究：通过了解活性物质与靶菌之间的相互作用方式，探究海洋真菌的抗菌机制。
常见的研究方法包括荧光染料技术、细胞膜通透性测定和蛋白质表达分析等。
产生物活性物质海洋放线菌的筛选和鉴定
菌检 测 ， 结果 显示 组分 Ｂ ３ １ — ３和 Ｂ ３ ４ ． ３不仅 对革 兰氏 阳性 菌金 黄 色葡 萄球 菌有较 好 的抑 茵作 用 ， 而
和浓 缩得 到粗提 物 ， 即Ｂ ３ １和 Ｂ ３ ４ ； 抗 菌作 用 的结 果显 示 ， 这 两种 粗 提 物 的抗 菌效 果 均 为显 著 。经
薄层层 析 分析 ， 并利 用 制备 型层析 板 对 粗提 物 Ｂ ３ １和 Ｂ ３ ４进 行 活 性物 质 的 分 离制备 ， 共 得 到 八 个
中国普 通微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 （ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ
Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ） ； 枯 草 芽 孢
基金项 目： 辽宁省 自然科学基金项 目（ ２ ０ １ ６ ０ ２ ０ ４ ７ ） ， 国家海洋公益性行业科研专项项 目（ ２ ０ １ ４ ０ ５ ０ ０ ３ ） ， 辽宁省教育厅重点实验室（ Ｌ Ｚ ２ ０ １ ４ ０ ２ ９ ） 。
物 质是 陆地 生物 所 没有 的 ， 因此 它有 着 重 要 的研 究
意 义 … 。海洋 占地 表 面积 的 ７ ０ ％， 是 生 物 资源 的宝 库 。海 洋 生 物 物 种 比 陆 地 生 物 丰多万种 ｊ 。 由于海 洋 环境 的特 殊性 ， 赋予生 活 在海 洋 中 的放 线 菌在 生理 性 状 和 遗
抗生海洋放线菌的筛选及其次级代谢物活性的研究
抗生海洋放线菌的筛选及其次级代谢物活性的研究海洋放线菌由于特殊的生态环境可能会产生各种不同于陆地微生物的生物活性物质,进而可以从中找到新的有效药物分子来抑制多种病原微生物及治疗肿瘤等恶性疾病。
本研究对日照海洋沉积物中的海洋放线菌进行分离筛选,并对筛选到的一株高生物活性的海洋放线菌进行条件优化及代谢产物活性研究,为后续分离纯化出结构新颖、功能独特、低毒副作用的次级代谢产物提供了理论依据。
（1）采用5种不同的处理方法和5种不同的筛选培养基从日照海洋沉积物中分离筛选出105株海洋放线菌,通过拮抗黄曲霉活性筛选,获得一株对黄曲霉具有较强抑制活性的抗生菌株SSRRZ-B11。
经16S rDNA序列分析,并结合形态观察及生理生化试验,确定菌株SSRRZ-B11为锈赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）。
（2）通过单因素实验优化海洋锈赤蜡黄链霉菌SSRRZ-B11菌株产抑菌活性物质的发酵条件,结果显示最适培养基为改良ISP2培养基;最适培养条件为:接种量为5%、培养温度30℃、初始pH 7.0、培养时间11 d、装液量为90 mL/300 mL。
通过P-B实验设计,确定了温度、培养时间和接种量为主要影响因子,通过最陡爬坡实验及响应面实验对产抑菌活性物质的发酵条件进行了研究,确定最适培养条件为:温度29℃、培养时间11 d、接种量5%,在此条件下实际抑菌活性物质的抑菌圈直径达到（29±0.1）mm,与原始发酵条件相比,抑菌活性物质活性提高了51.72%。
（3）使用沉淀法对海洋锈赤蜡黄链霉菌SSRRZ-B11菌株产抑菌活性物质进行初步提取,结果发现,80%饱和度下硫酸铵沉淀对黄曲霉的抑制活性保持率达到82.1%。
因此可以用硫酸铵分级沉淀法来对拮抗黄曲霉活性物质进行初步提取。
并在此基础上探讨了抑菌活性物质的温度、酸碱性、储藏时间、遗传稳定性,结果表明:SSRRZ-B11菌株所产抑菌活性物质对温度比较敏感,在60℃以下具有较高的稳定性;pH在4<sup>1</sup>0这一范围内能够保持稳定;储存到5<sup>1</sup>5 d之内其抑菌活性降低不显著,仍具有较强的活性;并且具有较好的遗传稳定性,这些研究为今后该抑菌活性物质的分离纯化提供了一定的理论依据。
海洋微生物活性物质的分类探讨
海洋微生物活性物质的分类探讨作者：林沅郑世成刘帛屿来源：《科技风》2018年第22期摘要：本文將对海洋真菌，海洋细菌，海洋放线菌三个方面进行逐步分析，并对其产生的抗菌活性物质以及抗肿瘤活性物质进行讨论，研究结果表明，大部分活性物质种类主要由海洋微生物的海洋细菌大菌群。
其次海洋真菌及海洋放线菌可产生的新型活性物质也不容小觑，尽管他们并不是主要菌群。
最后本文表明海洋微生物在我国开发海洋天然产物具有重要意义关键词：海洋；活性物质海洋作为地球生命重要的发源地，占地球表面积的71%，是人们赖以生存的重要保障。
近年来，随着人们对海洋微生物的研究逐渐深入，不断的发现了各种新型结构，功能多样的活性物质。
深入研究这些海洋活性物质对医药、食品、化工等方面具有重大意义，所以目前海洋开发的重要项目之一就是对海洋微生物的活性物质的研究。
1 海洋真菌产生的活性物质1.1 抗菌的活性物质海洋真菌为真核生物而且能形成孢子，生活在海洋之中。
大多数栖于某种基物而生活，少数自由生活。
Kohl me yer在1998年调查，已鉴定的海洋真菌有321种，其中有6种担子菌，255种子囊菌，60无性态真菌。
[1]很多的科研数据都表明：70%～80%的从海洋真菌分离出的次级代谢产物具有生物活性。
王书锦等[2]从中国黄海、渤海、辽宁等近海地区分离得到海洋真菌508株，已经鉴定的有20多株，主要有青霉属、曲霉属、镰刀菌属及新的真菌，10%以上发酵产物具有抗细菌或抗真菌生物活性。
1.2 抗肿瘤的活性物质20世纪50年代，Bergman就已经开始了对海洋生物抗肿瘤活性的研究，很多的海洋真菌都可以产生抗肿瘤的活性物质，有的从海水或海洋沉积物中分离，有的从其它海洋生物体分离，他们产生的抗肿瘤活性物质也大多具有新型的结构。
[3]日本学者[4]在日本海北部3000多米深的海泥中曾经分离得到了一株海洋细菌Alteromanas Haloplanktis，它能够产生可以抑制肿瘤细胞的离子载体代谢产物；Okamit等人曾经从黄杆菌属细菌中分离得到了一种多糖物质，能够很明显的抑制小鼠的S180实体瘤。
海洋源微生物的分离、鉴定及抑菌与抗肿瘤活性评价
世界最新医学信息文摘 2019年 第19卷 第24期109投稿邮箱：sjzxyx88@·药物研究·海洋源微生物的分离、鉴定及抑菌与抗肿瘤活性评价曾臻，谭强来（通讯作者）（厦门医学院，福建 厦门 361023）0 引言从陆生资源挖掘新型活性物质的难度日益加剧，科研工作者将目光逐渐转向海洋。
海洋微生物种类繁多且生存环境（如高压、高渗等）独特，常具有更丰富的代谢途径和活性产物，是新型天然药物的重要来源。
其中海绵源天然产物多由其共附生微生物产生，结构多样、活性显著，极具开发潜力[1]。
官颖颖等研究了南极海域海绵共附生放线菌的多样性及次级代谢产物的合成潜力[2]。
为高效且经济地评价微生物及其次级代谢产物，相关指标及方法的选择尤为重要。
其中，抑菌[3]与抗肿瘤活性[4]在筛选海洋微生物源先导药物最为典型。
鲍海燕等利用大肠杆菌差异性DNA 损伤修复试验（Differentiated DNA damage repair test, DDRT ）对海洋抗肿瘤活性真菌及产物进行筛选[4]。
DDRT 法简单、快速，兼顾抑菌、抗肿瘤活性。
因此，本文拟从厦门海域海绵中分离、纯化共附生微生物，并评价其抑菌与抗肿瘤活性，为合理利用海洋微生物资源宝库提供参考。
1 材料与方法1.1 材料。
海绵活体样品为厦门近海采集，经鉴定为喷喘苔海绵（Tedania anhelans ）。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens ）、白假丝酵母（Candida albicans ）均购自中国科学院微生物研究所。
大肠杆菌343/591和343/636均购自上海医药工业研究院。
E. coli DH5α、Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 载体购自宝生物工程(大连)有限公司，2216E 海水培养基、LB 肉汤、葡萄糖蛋白胨培养基等购自青岛海博生物技术有限公司，基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
海洋细菌的抑菌谱研究及鉴定
山 东 化 工 收稿日期：２０１８－１０－２３基金项目：国家自然科学基金（２１２７２０３１）；辽宁省自然科学基金指导计划项目（２０１７０５４０２０４）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（ｗｄ０１１９０）；大连民族大学创新创业训练计划资助项目（２０１８１２０２６０１７）作者简介：汪 浩（１９９８—），湖北黄冈人，大连民族大学生命科学学院生物工程专业本科生，研究方向：海洋微生物；通信作者：金黎明（１９７９—），女，朝鲜族，黑龙江牡丹江人，大连民族大学生命科学学院副教授，博士，研究方向：海洋微生物。
海洋细菌的抑菌谱研究及鉴定汪 浩，孙 怡，李思琪，李成伟，邢恩波，秦 香，金黎明（大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 １１６６０５）摘要：本实验采用琼脂扩散法研究了１１种来源于北冰洋沉积物的海洋细菌对９种人类和动物致病菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌）的抑菌谱。
并对效果最好的６５号菌株进行了鉴定，确定其为芽孢杆菌。
关键词：海洋微生物；致病菌；抑菌谱；鉴定中图分类号：Ｒ３７９．４；Ｑ９３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）０２－０００６－０２ 从自然界寻找高效的能够抗人类病原菌、动物病原菌的的化合物一直是研究者的热点之一，如何从天然资源中筛选和研发新型的抗生素，也是最近研究的趋势。
海洋微生物由于生存环境具有低温、高压、黑暗等特殊性，可能会产生结构新颖、作用机制独特的活性代谢产物，因此成为了近年来研究的热点之一［１－３］。
本实验以９种人类和动物致病菌致病菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌）为指示菌，研究海洋微生物的抑菌谱，并进行鉴定，为进一步研究其相关次级代谢产物以及其抗菌活性物质奠定基础，其应用前景广阔丰富。
１ 材料与方法１．１ 材料与试剂１．１．１ 实验材料海洋沉积物样品采集泥样为中国第六次北极考察沉积物样品。
北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选
北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选常显波;柳瑞翠;刘文正;张晓华【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(53)13【摘要】采用平板涂布法利用6种培养基从北极海洋沉积物中共分离出109株放线菌.选取34株代表菌株进行16S rDNA测序分析.结果表明,它们分属于链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),其中Streptomyces为优势菌属;不同采样点获得放线菌的种类和数量有较大不同,站位点P37分离到的放线菌数量和种类最多;在109株放线菌中,有39株对病原菌有抑菌活性,其中有21株、11株和17株放线菌分别对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长有抑制作用.【总页数】5页(P3014-3018)【作者】常显波;柳瑞翠;刘文正;张晓华【作者单位】烟台大学环境与材料工程学院,山东烟台264005;烟台大学环境与材料工程学院,山东烟台264005;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q939.99【相关文献】1.海绵放线菌的分离与抑菌活性筛选研究 [J], 杜英侠;任浩杰;张菊林;付晚涛2.红树林、海洋沉积物及北极3种不同生境真菌的分离及代谢产物活性筛选 [J], 董治统;闫晶晶;彭方;谢晴宜;洪葵3.北极海洋沉积物中可培养细菌及其多样性分析 [J], 王桢;李阳;车帅;林学政4.北极海洋放线菌R-527F的抗菌活性筛选、鉴定及其抗菌物质发酵条件研究 [J], 王毓舒;曾倩;俞勇;陈波5.金钗石斛根际土壤放线菌的分离及抑菌活性筛选 [J], 方正;詹伟;吴庆珊;安忠琦;牛晓娟;张传博;翁庆北因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第39卷 第5期 海 洋 与 湖 沼Vol.39, No.5 2008年9月OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICASep., 2008* 浙江省自然科学基金资助项目，402038号。
杨文鸽，博士，教授，E-mail ：yangwenge@ 收稿日期: 2007-08-17, 收修改稿日期: 2007-10-25海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究*杨文鸽1 楼乔明2 徐大伦1 孙爱飞1 潘云娣3(1. 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波大学生命科学与生物工程学院 宁波 315211; 2. 中国海洋大学食品科学与工程学院 青岛 266003; 3. 宁波出入境检验检疫局 宁波 315012)提要 采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析方法, 对从宁波海域滩涂泥样中筛选到的一株放线菌XS904进行分类鉴定, 同时对XS904菌株发酵液的抑菌活性和抑菌物质的理化性质进行了研究。
结果表明, XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens )的变种; 经液体培养, XS904菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌活性, 对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.78%; pH 纸色谱和捷克八溶剂系统纸层析结果显示发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的碱性抗生素, 易溶于三氯甲烷, 对温度较敏感, 在酸性和中性条件下稳定。
关键词 海洋放线菌, XS904, 分类鉴定, 发酵液, 抑菌活性 中图分类号 Q93放线菌是抗生素等制药工业最重要的微生物资源之一。
自Waksman(1943)从灰色链霉菌提取出链霉素以来, 在放线菌中已发现和分离到4000多种抗生素, 如链霉素、土霉素、卡那霉素、井冈霉素等已广泛应用于临床治疗和农业生产。
当前开发研究陆栖放线菌已相当深入, 从陆栖放线菌发现新的活性物质的几率正逐渐下降, 因此从海洋微生物资源中寻找新型微生物药物成为研究的必然趋势(Adinarayana et al , 2007; Janos, 2005; Maskey et al , 2004)。
据不完全统计, 自20世纪70年代东京微生物化学研究所从海洋放线菌Chainia sp.分离到抗生素SS-228Y 以来, 从海洋放线菌中发现结构新颖具有强生理活性的物质已达100多个, 其中90%以上产生于放线菌中的链霉菌属(林永成等, 2003)。
源于链霉菌的新生理活性物质不断被发现, 新链霉菌的分离、鉴定和活性物质的筛选已成为微生物来源新药筛选工作的重要课题(Muramatsu et al , 2004; 徐平等, 2005)。
本实验室从宁波海域滩涂泥样中筛选到一株海洋放线菌XS904, 经多次传代培养证实该菌株具有稳定的生理特性。
本文作者在形态观察、生理生化特征试验以及16S rDNA 序列相似性比较的基础上对XS904菌株进行分类鉴定, 同时对该菌株发酵液的抑菌活性进行研究, 旨为海洋放线菌的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株XS904 分离自宁波象山港海域滩涂海泥中。
1.1.2 供试菌 青霉(Penicillium sp.), 根霉(Rhizopus sp.), 曲霉(Aspergillus niger ), 啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis ), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ), 枯草杆菌(Bacillus subtilis ), 大肠杆菌(Escherichia coli )。
以上供试菌均由本院微生物实验室提供。
1.1.3 培养基 ① 改良高氏一号培养基：可溶性淀粉20g, KNO 3 1g, NaCl 0.5g, K 2HPO 4 0.5g, MgSO 4 0.5g, FeSO 4 0.01g, 琼脂15—20g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH7.2—7.4, 121℃灭菌20min 。
② 黄豆粉培养基：可溶性淀粉20g, 黄豆粉15g, 葡萄糖5g, 酵470 海洋与湖沼39卷母膏2.5g, CaCO3 1g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH 7.5—8.0, 121℃灭菌20min。
1.1.4主要试剂和仪器溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司, PCR试剂盒购自大连TAKARA生物技术有限公司。
Eiko HCP-2临界点干燥仪(日立公司), Eiko IB-5离子溅射仪(日立公司), Stereoscan 260扫描电镜(日立公司), PCR仪(美国Eppenderf公司)。
1.2菌株XS904的初步鉴定1.2.1形态观察XS904菌株利用插片法(钱存柔等, 1999)培养10—20d后, 利用Novel光学显微镜进行形态观察; 同时取出插片, 用2.5%戊二醛固定12h, 再用1%锇酸固定6h, 经各级乙醇脱水, 乙酰异戊酯置换, CO2临界点干燥, 喷金镀膜, 扫描电镜观察菌体形态特征。
1.2.2培养特征与生理生化特性研究依据《链霉菌鉴定手册》(中国科学院微生物研究所放线菌分类组, 1975)和《放线菌分类基础》(阮继生, 1977)中推荐的常用微生物鉴定方法, 观察并记录菌株的培养特征与生理生化特性。
1.316S rDNA PCR扩增1.3.1菌体总DNA的提取参照Hopwood等(1985)方法提取菌体总DNA。
1.3.2 16S rDNA PCR扩增正向引物PA(对应于E. coli的16S rDNA 5′端8—27f位核苷酸)：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 反向引物PB(对应于E. coli的16S rDNA 5′端1523—1504r位核苷酸)：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR扩增条件：以热启动方式进行扩增, 94℃预变性5min; 加Taq酶后94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸3min, 共30个循环; 最后72℃延伸5min。
1.3.3 16S rDNA PCR扩增产物的纯化及测序由上海英骏生物技术有限公司协助完成。
1.4系统进化树的构建和分析将所得到的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行相似性搜索, 选取同源性较高的16S rDNA序列作为参比对象, 用MEGA3.1软件进行多序列比对, 根据Kimura-2参数法计算进化距离, 并采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。
1.5XS904菌株发酵及发酵液预处理菌种经斜面活化后, 将孢子用无菌水洗下, 孢子悬液接种于黄豆粉培养基, 28℃、160r/min摇床培养5d; 发酵结束后, 经减压抽滤, 上清液于－20℃保存备用。
1.6XS904菌株发酵液抑菌活性测定抑菌圈直径测定：采用滤纸片法(林鹏等, 2005), 取6mm无菌滤纸片, 加入5ml发酵液, 贴于带菌培养基上, 以黄豆粉培养基作对照, 细菌37℃培养1d, 真菌37℃培养2d, 十字交叉法测量抑菌圈直径。
最小抑菌浓度测定：以原发酵液浓度为100%, 用3%海水晶溶液进行倍比稀释2、4、8、16倍后浓度分别为50%、25%、12.5%、6.25%, 依次类推。
滤纸片法测定不同浓度发酵液的抑菌情况。
发酵液抑菌活性物质对温度和pH的稳定性测定(邵彦坡等, 2007)：取发酵液30ml分别在30—100℃水浴中放置30min, 冰浴冷却至室温, 测定不同温度处理后发酵液的抑菌情况; 取发酵液30ml, 用稀酸或稀碱将pH分别调至3.0—10.0, 静置24h后, 调至原始pH, 测定不同pH处理后发酵液的抑菌情况。
1.7发酵液抑菌活性成分极性分析用等体积的三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯对发酵液进行萃取, 搅拌4h后于分液漏斗中静置过夜, 分别取水相、有机相进行抑菌活性测定。
1.8发酵液抑菌活性成分纸层析分析1.8.1pH纸层析(刘姝等, 2007) 取9条滤纸条(10mm×160mm), 分别用pH2.2、pH3.0—10.0的缓冲溶液处理, 干燥后点上发酵液样品, 用水饱和的乙酸乙酯溶剂进行上行展层, 之后将滤纸条晾干进行生物显影。
1.8.2捷克八溶剂系统纸层析(周德庆, 1980) 取8条滤纸条(10mm×160mm), 点样后分别在8种展层溶剂中层析, 5% Na2SO4处理, 晾干后进行生物显影。
捷克八溶剂系统编号如下：1号水饱和的正丁醇; 2号水饱和的正丁醇, 内含2%对甲基苯磺酸; 3号正丁醇 : 乙酸 : 水= 2 : 1 : 1; 4号水饱和的正丁醇, 内含2%六氢吡啶; 5号正丁醇饱和的0.5mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0); 6号正丁醇饱和的水, 内含2%对甲基苯磺酸; 7号苯 : 甲醇 = 4 : 1, 所用滤纸先用0.5mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)处理后晾干; 8号甲醇：水(内含3% NaCl) = 3 : 1。
2结果与分析2.1菌株鉴定2.1.1形态特征在改良高氏一号培养基上, XS904菌株生长良好, 菌落表面呈粉绒状凸起, 并带5期杨文鸽等: 海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究 471有明显褶皱; 菌落最初为白色, 随后慢慢变成灰色或灰白色。
该菌株气生菌丝发育良好, 成熟后生成孢子丝, 孢子丝直至螺旋状; 基内菌丝丰富, 多分支, 不断裂(图1)。
电镜扫描结果显示XS904菌株孢子链长, 分化为孢子, 孢子圆形至卵圆形, 表面有粗刺(图2)。
图1 菌株XS904的光学显微镜照片(400×)Fig.1 Optical micrograph (400×) of strain XS904图2 菌株XS904的扫描电镜图Fig.2 Scanning electron micrograph of strain XS9042.1.2培养特征利用不同的培养基培养, XS904菌株除在酪氨酸琼脂培养基上长势一般外, 大部分合成培养基上生长良好。
XS904菌株均不产生可溶性色素, 所产的气生菌丝与基内菌丝的颜色不同, 具体结果见表1。
2.1.3生理生化特性XS904菌株能使明胶液化、淀粉水解、纤维素水解、牛奶凝固而不胨化; 不产生硫化氢、不还原硝酸盐; 可利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、肌醇、蔗糖、甘油、半乳糖作为碳源生长, 不能利用鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、天冬氨酸。
2.1.4 16S rDNA全序列的相似性比较和系统发育分析菌株XS904的16S rDNA序列长度为1490bp,表1菌株XS904的培养特征Tab.1 The cultural characteristics of strain XS904 培养基生长情况气丝颜色基丝颜色葡萄糖酵母琼脂好白色黄色伊莫松较好白色桔黄色酪氨酸琼脂一般灰白色乳白色蔗糖察氏好橄榄绿色淡黄色燕麦粉琼脂较好微绿灰乳白色无机盐淀粉较好浅绿灰色乳白色营养琼脂较好乳白色淡黄色NCBI的序列登记号为：DQ826592。