第三章基因工程的载体
第三章基因工程载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
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β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
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(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
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单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
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(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
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(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
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根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程的载体
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
《基因工程》第三章 载体2
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程基因工程的载体
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苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程的载体和受体
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Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the
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（2）一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起 始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Amp、Kan。 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段。 P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子。 T（Terminator）：终止信号。 poly(A)加尾信号：稳定mRNA。
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（1）质粒改造策略
删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片 段的装载量。 灭活某些质粒的编码基因。 加入易于识别的选择标记基因。 选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列--多克隆接头(Polylinker)。 加入特殊的基因表达调控元件。
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（4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
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（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例：
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三章基因工程的载体一、概述二、质粒载体三、表达载体一、概述•1 概念•载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。
•克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
•表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。
一、概述•2 功能•运送外源基因高效转入受体细胞；•为外源基因提供复制能力和整合能力；•为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
一、概述•3 分类•按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体•按功能和用途分：克隆载体和表达载体•按性质分：融合型载体和非融合型载体•按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体一、概述•4 特性•载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；•载体容易从宿主细胞中分离纯化；•有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；一、概述•4 特性•能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；•载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；•载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；•用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子二、质粒载体1、质粒的基本特性2、常用的质粒载体3、质粒DNA的提取4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化二、质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。
1、质粒的基本特性（1）概念①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；③大小为1 kb-200 kb，也有更大的。
双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）构型：共价闭合环状、开环和线性（2）质粒的复制﹡ 复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
﹡ 复制子有不同的组成方式：滚环、θ等；﹡ 在E.coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子。
（3）拷贝数严谨型：拷贝数较少，大约1-几个松弛型：拷贝数较多，几十至几百一些质粒载体所携带的复制子及拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB1 15-20 pUC载体pMB1 500-700 pACYC及其衍生质粒p15A 10-12（4）质粒的不相溶性﹡ 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相溶性。
﹡ 在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相溶的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。
（4）质粒的不相溶性﹡ 不相溶群：指那些具有不相溶的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
现已发现30多个不相溶群。
（5）转移性﹡ 在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。
﹡ 要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点。
﹡ 例：pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白质作用下，通过接合性质粒来进行转移，但大多数载体无nic/bom位点（如pUC ）。
（6）选择标记选择标记基因用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来。
(1)氨苄青霉素抗性基因ampicillin,Amp r, amp r青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。
Amp r编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。
（2）四环素抗性基因tetracycline,tet r四环素与核糖体30 S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。
tet r基因编码一个由399个aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
（3）氯霉素抗性基因chloramphenicol,Cm r, CatCm与核糖体50 S亚基结合并抑制蛋白质合成。
Cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白，每个亚基23 kDa。
氯霉素乙酰转移酶在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合。
（4）卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin / neomycin 可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷。
这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)-II)所灭活，该酶为25 kDa ，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞质内的主动转移。
（5）Sup F琥珀突变抑制基因终止密码：UAA（赭石），UAG（琥珀），UGA（乳白）Sup F编码细菌的抑制性tRNA，在某一宿主中含具琥珀突变的tet r和amp r，只有当含Sup F的质粒转入后，宿主才会对amp和tet具抗性。
（6）其它正向选择标记质粒可编码一种使某些宿主菌致死的记忆产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。
筛选标记插入失活：在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。
筛选标记α-互补（α-complementation ）Lac Z ´基因的互补编码缺失第11-41位氨基酸宿主LacZ LacZ ΔM15β-半乳糖苷酶1024 aa载体140 aa140 aa+MCS LacZ ´IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Isopropyl-β-D-Thiogalactoside诱导物X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside 底物（生色剂）β-半乳糖苷酶分解x-gal形成蓝色产物MCS：Multiple cloning sitesLacZ ΔM15LacZ´IPTG/x-galLacZ ΔM15LacZ ´蓝色LacZ ΔM15 LacZ ´ΩDNA IPTG/x-gal白色在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和前140个aa的编码信息，在这个编码区中插入一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在β-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。
lacZΔM15编码缺失第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶，但无酶学活性。
当LacZ´与lacZΔM15的产物混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/（MCS），并在受体菌中引入lacZΔM15即可实现α-互补。
在生色底物（x-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源基因插入到质粒的MCS后，几乎不可避免地导致产生α-互补能力的氨基酸片段。
α-互补：LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
lacZΔM15 放在F质粒上，随宿主传代lacZ ´放在载体上，作为筛选标记相应的受体菌：TG1，XL1-Blue，JM101等。
（7）质粒载体的多克隆位点基因工程载体含有一个人工合成的多种限制性内切核酸酶的单一识别序列，称为多克隆位点（multiple cloning site, MCS)（8）质粒DNA的电泳特征共价闭环DNA：covalentlyclosed circular DNA,cccDNA开环的双链环状DNA：open circular DNA，ocDNA线形DNA：linear DNAL-DNA 共价闭环DNA开环的双链环状DNA 线形DNA2、常用的质粒载体具备以下特点：①在宿主细胞内必须能进行自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选。
（1）pSC101，ColE1载体较大，酶切位点少﹡ 转化效率与大小成反比，大于15 kb转化效率成为限制因素；﹡ 质粒约大，约难于用限制酶切进行鉴定；﹡ 质粒约大，拷贝数越低。
改进策略：﹡ 去掉多余片段﹡ 提供多克隆位点﹡ 筛选标记﹡ 增加辅助功能：表达载体（2）pBR3224361 bpGenBank V01119,J01749 含有30多个单一位点amp r和tet r可通过插入失活进行筛选（3）pUC18，pUC19﹡ 2686 bp﹡ GenBank L08752/X02514﹡ 来自pBR322﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：cloningexpression(利用lacZ promoter)sequence(universal and reverse prime)pUC18（4）pUC118，pUC119﹡ 3162 bp﹡ GenBank U07649/U07650﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：分离ssDNA，诱变，探针，测序pUC118 pUC119（5）pBluescript M13+、M13-又叫pBluescript SK+、SK-﹡ 2960bp﹡ GenBank X52325/X52326﹡ amp r﹡ 在MCS位点两侧，含有一对T3和T7噬菌体的启动子﹡ α-互补﹡ 用途：测序，探针pBluescript SK+、SK-（6）pSP64、pSP65﹡ 2999/3005 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体SP6的RNA聚合酶启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pSP64 pSP65（7）pGEM-3Z﹡ 2743 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体的T7和SP6启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pGEM-3Z（8）pUCm-T﹡商业化的克隆载体﹡用于PCR产物的克隆﹡2773 bp﹡amp r3、质粒DNA的提取质粒DNA的小量制备（碱裂解法）（1）细菌的培养将3 ml含相应抗生素的LB培养基加入到10 ml的细菌管中，然后接入一单菌落，于37℃、150 r/min下培养过夜。
（2）细菌的收获将1.5 ml细菌培养物加入1.5 ml离心管中，于4℃、8000 r/min离心30 s，倒掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。