原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
细胞传代培养和原代培养
细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
原代细胞传代培养步骤
原代细胞传代培养步骤引言原代细胞传代培养是细胞生物学研究中常用的技术手段之一。
它是指从活体组织或器官中分离得到的原代细胞，通过定期的传代培养，使其继续生长并保持其生物学特性。
本文将详细介绍原代细胞传代培养的步骤和注意事项。
准备工作在进行原代细胞传代培养之前，我们需要准备好以下工具和试剂：•细胞培养基：选择适合特定细胞系的培养基，常用的有DMEM、RPMI-1640等。
•离心管：用于离心细胞，分离上清液和沉淀。
•培养皿：提供细胞黏附和生长的平台，常用的有培养瓶、96孔板等。
•传代液：通常为含有生长因子和抗生素的培养基。
•培养箱：提供细胞培养所需的恒温和二氧化碳环境。
步骤步骤一：细胞收集1.准备组织或器官：选择合适的组织或器官，并保持其在解剖过程中的无菌状态。
2.组织分离：将组织或器官剪碎，并加入适当的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等进行消化。
3.离心分离细胞：将消化后的组织离心，以分离出上清液和含有细胞的沉淀。
步骤二：细胞培养1.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪进行细胞计数。
2.接种细胞：将细胞按照一定比例加入含有细胞培养基的培养皿中。
3.培养条件：将培养皿放入预先调试好的培养箱中，保持适当的温度（通常为37摄氏度）和二氧化碳浓度（通常为5%）。
4.观察细胞生长：每天观察细胞的生长情况，记录细胞的形态和数量等信息。
步骤三：传代培养1.细胞达到80%～90%的密度时，可以进行传代培养。
2.清除培养液：将培养皿中的培养液倒掉，用无菌PBS对细胞进行冲洗，以去除残留的培养基和细胞碎片。
3.添加胰蛋白酶等消化酶：根据细胞系的特性和耐受性，加入适量的胰蛋白酶，进行细胞的消化。
4.停止消化：加入含有细胞培养液的离心管，停止细胞的消化过程。
5.离心分离：将细胞悬液离心，以分离出上清液和细胞沉淀。
6.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪对细胞进行计数。
7.接种细胞：将计数后的细胞按照一定比例加入含有传代液的培养皿中。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事项
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事
项
细胞原代培养也被称为组织块培养法，是一种从组织中分离和培养原代细胞的方法。
以下是细胞原代培养的实验步骤和注意事项：
1.组织分离：首先需要从生物体中收集组织样本，如肝、肺、心脏等。
样本需要通过消化或机械分离等方法分离出单个细胞或小组织块。
消化方法可以使用胰酶或胰蛋白酶等酶类来消化样本，机械分离则需要使用切割器或剪刀等工具。
2.细胞培养：分离出的组织块需要在含有营养物质和生长因子的培养基中培养。
在培养过程中需要注意不要过度培养，否则会导致细胞老化或死亡。
3.传代：当细胞达到一定密度时，需要将其分离并移至新的培养皿中进行传代，以维持细胞的生长和繁殖。
注意事项：
1.细胞的培养需要在严格的无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.选择适当的培养基和生长因子，以保证细胞的生长和分化。
3.细胞培养过程中需要定期观察细胞的形态和生长情况，以及细胞浓度，以便及时进行传代。
4.细胞应该在体外保持与体内相似的环境和温度，以提高细胞的存活和生长率。
5.尽量使用新鲜的组织样本，避免长时间冷藏或保存，以保证细胞质量和数量的优良。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
细胞培养的过程及注意事项
36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。
原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。
1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。
再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。
2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。
要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。
原代huvec细胞培养注意事项
原代huvec细胞培养注意事项
原代HUVEC细胞是一种常用的血管内皮细胞模型，主要用于研究血管生物学和心血管疾病的发生机制。
在进行HUVEC细胞的培养时，需要注意以下几点。
选择适当的培养基。
常用的HUVEC细胞培养基包括EGM-2和M199等，可以根据实验需要选择合适的培养基。
在培养基中添加适量的胎牛血清或人血清，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
维持适宜的培养条件。
HUVEC细胞对温度和CO2浓度较为敏感，一般在37摄氏度、5% CO2下培养。
此外，保持培养皿内的湿度也很重要，可以在培养皿内加入一些水或PBS来增加湿度。
注意细胞的传代和增殖。
HUVEC细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到80%到90%时，应及时进行传代。
传代前要用PBS 洗涤细胞，然后使用胰酶将细胞从培养皿上剥离下来，最后用新的培养基重新培养。
注意细胞的纯度和鉴定。
HUVEC细胞的纯度对实验结果的准确性有重要影响，因此需要对细胞进行鉴定。
常用的方法包括免疫细胞化学染色和流式细胞术等。
注意细胞的保存和储存。
HUVEC细胞可以冷冻保存，使用液氮保存细胞可以延长细胞的保存时间，并且可以避免细胞的突变。
在冷冻
保存之前，需要将细胞用含10% DMSO的培养基悬浮，并分装到冻存管中，再放入液氮中保存。
HUVEC细胞的培养需要严格控制培养条件，注意细胞的传代和纯度鉴定，以及细胞的保存和储存。
只有做好这些注意事项，才能保证细胞的正常生长和实验结果的准确性。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
传代培养的注意事项
传代培养的注意事项传代培养是细胞生物学实验中常用的方法之一，用于维持和繁殖细胞株。
在进行传代培养时，有一些注意事项需要遵守，以确保细胞的健康和稳定生长。
以下是传代培养的一些重要注意事项。
1. 无菌操作：在进行传代培养之前，必须进行彻底的无菌操作，以避免细胞受到细菌、真菌或其他微生物的污染。
在进行培养操作前，应该使用消毒剂擦拭工作台面，并穿戴好相应的个人防护装备，如实验手套和口罩。
2. 培养皿和培养物质的选择：在进行传代培养时，应选择适当的培养皿和培养物质。
常见的培养皿有培养瓶、培养皿和多孔板等。
培养物质主要包括培养基、培养液和培养辅助物质。
根据细胞类型和特殊要求选择合适的培养皿和培养物质。
3. 细胞密度的控制：在进行传代培养时，要注意细胞的密度控制。
细胞密度太高会导致细胞过度接触和竞争，从而影响细胞生长和增殖。
细胞密度太低则会增加传代消耗的时间和工作量。
根据细胞的生长速率和传代的目的，确定合适的细胞密度。
4. 传代的时间点：传代时应选择合适的时间点。
细胞应在处于活跃的生长期进行传代，一般选择细胞达到对数生长期时进行传代。
此时，细胞的代谢活跃，增殖能力强，对培养环境的适应能力也较强。
5. 传代的方法：常见的传代方法有机械传代和酶消化传代等。
机械传代是通过离心去除培养基，然后用细胞分离剂或刮棒等工具将细胞从培养皿上分离下来。
酶消化传代是使用相应的消化酶将细胞与培养皿分离。
选择合适的传代方法，并根据细胞类型和需要进行操作。
6. 培养条件的控制：在进行细胞传代培养时，要注意细胞的培养条件。
包括培养基配方的控制，培养基温度和pH值的调节，培养皿存放位置和通气情况的控制等。
这些因素直接影响细胞的生长和繁殖，应根据具体要求进行调节和控制。
7. 传代次数的控制：每个细胞株都有一定的传代次数限制，超过限制次数后细胞会发生衰老和突变，影响其生长和功能。
因此，在进行传代培养时应注意记录传代的次数，并根据实验的需要合理控制传代次数。
细胞的传代
细胞的原代培养与传代一、原代培养：1 、概念：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
2、培养方法：最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。
分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。
如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
传代培养：1、概念：当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80% 汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
2、传代方法：（1）悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000 转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
（2）半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
（3）贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
7二、冻存与复苏：1、原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
原代细胞培养操作注意事项
原代细胞培养操作注意事项细胞培养是一项重要的生物学实验技术，而原代细胞培养更是在许多实验室中不可或缺的。
以下是一些关于原代细胞培养操作的注意事项：
1.预备工作：在开始前先准备好所有的材料和设备，如生物安全柜、培养皿、培养基、无菌针头、细胞培养试管等。
确保所有的设备和材料都已经消毒，以避免污染细胞。
2.细胞来源：原代细胞通常来源于组织样本，例如血液、肝脏、脑组织等，应保证其种质纯度和无感染。
细胞种植的密度也应该是适当的，以确保细胞的健康生长。
3.培养基：选择适当的培养基对原代细胞生长至关重要。
培养基的成分应当是足够的，以保证细胞生长的支持和繁殖。
不同类型的细胞需要不同种类的培养基。
4.填充和更改培养基：原代细胞在培养皿中需要经常更换和填充培养基。
操作时应该注意不要将培养基中的氧气驱出，否则会影响细胞生长。
5.细胞通量：在进行悬浮细胞培养时，需要注意细胞通量的控制。
细胞通量过高或者过低都会影响细胞生长和繁殖。
总之，在进行原代细胞培养时，需要严格控制所有操作细节，保证细胞的健康生长和繁殖。
原代培养和传代培养的理解
一、原代培养和传代培养1、原代培养定义：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、化学试剂或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
注意：人体是复杂的，一般从器官取出的组织都是很多类型细胞混合组成的（规范的说是多克隆，定义见下一条），也就是有很多种类型的细胞，基本上是不可能提取出来一种类型的细胞（单克隆）的，那个概率太小了。
TIPS：克隆在细胞培养中的定义：是原代培养开始时，揪出来的那一坨组织中的细胞类型数，有一种类型就是单克隆，两种类型就是两个克隆，很多类型就是多克隆（比如你肌肉组织，里面不但有肌肉细胞还有神经细胞，于是就是双克隆）2、传代培养定义：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
记住：神经细胞等终末分化细胞是没有传代培养的，因为它们无法复制注意：十代之前为原代，十代之后为传代的说法是完全可以的，但这是一个经验规律（一般细胞培养十代长满培养基），不具有普适性，但做题的时候用的基本上都是这个，不要杠精，特殊说明除外。
TIPS:癌细胞是一种特殊的细胞，它不具有贴壁生长特性，还不具有接触抑制作用，所以临床上常说癌细胞具有扩散性细胞系：直译就是细胞的集合，实际意义是进行传代培养后（这是前提！！！），对原代培养所使用的那一坨组织的称呼。
二、分离：酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶1、胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
为什么不用胃蛋白酶？因为胃蛋白酶最适PH值2.0左右，而且胃蛋白酶很生猛，消化完不但细胞之间连接没了，细胞也没了。
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养是一种非常重要的实验技术，它可以用于研究细胞的生长、分化、代谢等方面。
但是，原代细胞培养也有一些注意事项需要我们注意，下面就来详细介绍一下。
原代细胞培养需要注意细胞来源。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的细胞，因此需要注意细胞来源的选择。
一般来说，选择健康的、无感染的组织或器官作为细胞来源，可以获得高质量的原代细胞。
原代细胞培养需要注意细胞的处理。
在分离细胞时，需要使用无菌的工具和培养基，避免细胞受到污染。
同时，需要注意细胞的处理时间，过长或过短的处理时间都会影响细胞的生长和分化。
第三，原代细胞培养需要注意培养条件。
细胞的生长需要适宜的培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度、营养物质等。
因此，在进行原代细胞培养时，需要选择适宜的培养条件，以保证细胞的正常生长和分化。
第四，原代细胞培养需要注意细胞的传代。
细胞的传代次数过多会导致细胞的老化和突变，因此需要注意细胞的传代次数。
一般来说，原代细胞的传代次数不宜超过3-5次。
原代细胞培养需要注意细胞的检测。
在进行原代细胞培养时，需要对细胞进行定期检测，包括细胞形态、生长速度、细胞周期等方面。
如果发现细胞出现异常，需要及时停止培养并进行检测。
原代细胞培养是一项非常重要的实验技术，需要我们在实验过程中注意细胞来源、处理、培养条件、传代和检测等方面，以保证获得高质量的原代细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
初代培养
原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：动物组织块
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒
初代消化培养法
1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速
（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法
1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。
3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。
4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。
置温箱中静止培养。
待细胞从组织块游出数量增多后。
再补加培养液。
传代培养法
原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时
也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
材料和试剂
1. 细胞：贴壁细胞株
2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）
3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
操作步骤
1. 吸除培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。
3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。
注意加Hanks 液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。
5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
无菌操作注意事项
1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。
试剂等瓶口也要擦试。
2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。