细胞传代培养标准操作规程
mlf细胞传代实验步骤
mlf细胞传代实验步骤细胞传代实验是生物学研究中常见的一种实验方法，主要用于医学研究、提供细胞种和进行细胞生物学研究。
在进行细胞传代实验时，需要注意控制细胞密度、使用合适的培养基、避免细菌和真菌污染等问题。
以下是细胞传代实验的具体步骤：1.细胞培养：从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代。
细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养。
2.细胞分离：将原代培养的细胞进行分离，常用的方法有消化法、直接吹打法和离心分离法等。
不同类型的细胞需采用不同的分离方法。
3.细胞传代：将分离后的细胞进行传代，通常以1:2或1:3的比例进行分瓶。
传代过程中，需注意观察细胞分散情况，避免出现细胞成团现象，确保传代后的细胞为单细胞悬液。
4.细胞检测：传代实验后，对细胞进行检测，观察细胞的生长状况、形态特征等，以判断传代是否成功。
常用的检测方法包括显微镜观察、细胞计数、细胞活力检测等。
5.细胞冻存：对于需要长期保存的细胞，可以进行细胞冻存。
将细胞悬液与冷冻保护剂混合，然后放入低温冰箱或液氮中保存。
6.细胞复苏：当需要使用冻存细胞时，将其从低温冰箱或液氮中取出，逐步升温至室温，然后进行细胞培养。
7.细胞废弃处理：在实验过程中，会产生废弃细胞和培养液。
废弃细胞中含有生物活性物质，需进行适当的处理，避免对环境造成污染。
常用的处理方法包括消毒、灭菌、焚烧等。
通过以上步骤，可以顺利进行细胞传代实验。
在实验过程中，应注意细胞密度、培养基选择、污染防控等方面的问题，以保证实验结果的准确性和可靠性。
细胞传代标准操作流程
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细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞培养传代标准操作规程
1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。
4、Vero细胞培养传代操作规程4。
1试药与试液1、细胞：Vero细胞。
2、液体：0。
25%胰蛋白酶溶液；7。
5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。
4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。
4。
3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。
2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。
0℃±0。
5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。
7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4。
3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。
细胞传代具体操作(1)
一、生物安全柜的操作规程1.进入细菌、细胞间进行实验，必须穿上白大褂和乳胶手套，才能开始后续所有实验操作。
2. 生物安全柜内必备用品：酒精灯、打火机、1000μl枪、200μl枪、200μl枪头一盒、1000μl枪头一盒、移液枪、擦台面的泡有棉球的酒精瓶、装有EP管的瓶子、镊子、记号笔、细胞培养瓶（最多一袋）。
3. 开启紫外灯灭菌之前，请用酒精棉球擦拭台面，并且注意检查如下几点：准备一个废液缸，放入生物安全柜中；移液管是否够用，生物安全柜里面保证至少有一筒装有移液管的铁皮桶；酒精灯的酒精量是否够，若不够请及时添加工业酒精；移液枪是否有电，发现移液枪吸液速度慢了请及时充电；1000μl和200μl枪头是否够，保证生物安全柜里面有各有一盒；擦台面的棉球是否还有，若没有了请及时添加棉球（将医用脱脂棉撕成适宜大小的棉球）和75%酒精；各种型号EP管是否还有，没有了请及时灭菌放入生物安全柜内。
4. 灭菌消毒：开启紫外灯灭菌20-30分钟保证柜内空间无菌，如果紧接着其他实验使用生物安全柜，灭菌5-10分钟即可。
5. 灭菌完后，请打开风机，将挡板升高到一定高度，抽气5-10分钟，将臭氧全部排出。
6. 生物安全柜内所有操作必须带乳胶手套。
7. 实验完毕后，请适当处理废弃物，并且再次用酒精棉球擦拭台面。
8. 生物安全柜内只放一些必备用品，以免影响操作。
如果是私人实验所需物品，请在紫外灭菌之前将其放入进行灭菌。
紫外灭菌后，带入生物安全柜内操作的物品必须先经过灭菌处理。
为了方便他人实验，实验完毕后请务必将私人的实验用品取出。
二．细胞培养箱操作规程1. 培养箱每周换两次超纯水，每两月清洁培养箱一次。
清洁时用75%医用酒精擦拭培养箱，擦拭过程中应关闭培养箱。
2. 取放细胞的过程中严禁对着培养箱内说话，避免引入细菌；取放细胞的手套要喷过酒精，放进培养箱的培养瓶盖最好用75%医用酒精擦拭过。
3. 调节CO2钢瓶的压力为0.05–0.08 MPa，调节压力的时候应关闭培养箱，除仪器负责人不应随便调节CO2压力和仪器参数。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。
细胞培养操作流程
细胞传代培养操作流程细胞复苏：1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
如配置：50mL完全培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗)44.5mL基础培养基+ 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。
2. 戴防护手套后，自液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡），轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内，再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10)，混合均匀，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。
取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。
(Sf9细胞在27℃生长，可不需CO2)4. 一般而言，细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。
若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1300rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
传代培养：1.37℃恒温培养约48小时，待细胞长满80-90%后，从培养箱取出75cm2培养瓶，倒掉培养基。
加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清，倒掉缓冲液。
2.沿壁（无细胞的一面）缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min，轻轻摇晃，倒掉残余胰酶，将培养瓶置于恒温箱中约1min，拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。
注意：最佳消化温度是37℃，加液后用移液管反复吹打分散细胞。
3.向瓶中加入5mL完全培养基，反复吹打均匀2min，从中取出20μl至0.5ml小离心管中，向管中加入80μl台盼蓝溶液，混匀，从混合液中取出10μl至盖好盖玻片的计数板上，计算细胞密度及活率。
4.将5mL细胞悬液全部吸出，分别接种1mL悬液到原培养瓶与另一新的培养瓶中，其余舍弃。
MSC细胞传代培养标准操作流程(2)
间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。
2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。
3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。
3.2溶液配制记录。
3.3清场记录。
4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。
4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。
4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。
5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。
5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。
5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。
5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作1、细胞：贴壁细胞株2、操作步骤1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml 培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。
5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。
细胞传代培养操作
细胞传代培养操作步骤1、操作前紫外照射超净工作台，至少15min2、酒精擦拭双手，取出培养液和胰酶，并用酒精喷拭/擦拭培养液和胰酶瓶子等所用器材。
注意手不要接触瓶子的盖子部分。
3、酒精棉擦拭超净工作台，放入培养基、胰酶和废液缸等所用器材。
4、取出细胞，电镜观察。
酒精喷手后从培养箱中取出细胞，放在显微镜下观察细胞生长状态。
5、培养皿放入超净台，打开盖子，盖口朝下防止污染。
盖子打开后，手不能从培养皿上划过。
6、吸取旧培养液，加胰酶消化。
小心倒掉培养皿中培养基，剩余液体枪头吸出，换枪头，吸取1ml胰蛋白酶液，沿着培养皿壁轻轻打出胰酶（不要朝着细胞打），轻轻摇摆培养皿，使得胰酶覆盖过所有细胞。
约30s，小心吸出胰酶。
任何手接触培养皿的过程中，都不准触碰培养皿的壁沿，防止污染。
同样，盖培养皿、培养瓶、等盖子时，盖子要准确一次盖好，盖子不要触碰到瓶口或培养皿口。
胰酶盖子有液体也要用枪吸干，同样培养皿等口有液滴也要吸干。
7、吹打分散细胞。
吸取1-2ml的新鲜培养液，小心吹打培养皿上覆盖的贴壁细胞，直至细胞从培养皿壁滑落，细胞分散混匀。
吸取悬液，朝着培养皿底部吹打。
8、显微镜观察。
吹散后，显微镜观察细胞是否分散成个体，否的话继续吹散。
9、细胞分装。
准备新的已灭菌的培养基，吸取少量悬液加入到新的培养皿上。
每个培养皿再各加如10ml的新鲜培养液。
采用“十”字法轻轻摇晃混匀，小心液体溅出。
10、显微镜观察确认细胞已分散，放入37摄氏度恒温箱培养。
11、间隔1天后再观察细胞生长状况。
细胞冻存步骤1、选择细胞处于生长期2、。
细胞传代培养
1细胞传代准备工作1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。
1.2细胞传代材料，滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。
2细胞传代步骤2.1人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。
2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
2.4超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
2.5贴壁细胞的传代2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。
2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。
2.5.3以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。
2.5.4在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。
2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。
2.5.6用弯头滴管，吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。
2.5.7计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7～10ml／大瓶，3～5 mL ／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来，把细胞悬浮液加入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.2把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.4把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
细胞培养传代标准操作规程.pdf
7、收拾所用物品、用 75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4.3.2 填写记录： 1、随试验进程做好试验记录 ( 按实验记录规范要求 ) ，包括试剂的厂家、批 号、效期 , 试验时间 , 试验结果。签字 2、填写仪器使用登记。 4.4 复核人复核
复核人复核、签字。 4.5 结果与判定 每天用显微镜观察细胞形态。
文件名称
Vero 细胞培养传代标准操作程序（ SOP）
文件编号 起草人 审核人
YY-33001-2016(01) 关威
批准人
页码 起草日期 审核日期 批准日期 执行日期 版本号
第
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2016 年 4 月 19
年月
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01 分发号
细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规 范化。为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培 养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
酶消化效果最佳），每 1min 把培养瓶拿到倒置显微镜下观察， 当观察到细胞变圆， 透亮，细胞间隙明显增大时 ,加入先配好的完全培养基适量终止消化，用吸管轻 柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多 少密度的细胞具体几天可以长满 ,待有经验后此步骤可以省略。 ）
2、范围 ：适用于 Vero 细胞培养传代实验人员。 3、编制依据 《企业注册标准 WS4-(S-009-2)-2003Z》。 4、Vero 细胞培养传代操作规程 4.1 试药与试液 1、细胞： Vero 细胞 。 2、液体： 0.25%胰蛋白酶溶液； 7.5%碳酸氢钠溶液；小牛血清； PBS 缓冲 液； 10×199 培养液、灭菌注射用水、 EDTA 溶液。 4.2 仪器与用具 1、恒温培养箱； 2、倒置生物显微镜。 4.3 操作方法 4.3.1 细胞培养、传代 1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台 30min。 2、挑选细胞形态佳、无污染的 Vero 细胞，弃旧生长液。 3、细胞面经少量 EDTA 溶液洗涤后，加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺 平培养瓶底为佳） ，倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回 缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去， 4、把细胞培养瓶置 37.0℃± 0.5℃孵育让残存的胰酶继续消化， （在 37℃胰
细胞传代标准操作规程
细胞传代标准操作规程细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞倍增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。
（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将实验所需培养基置37℃下预热。
3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
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细胞传代培养（消化法）标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
1. 传代前准备
（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
（5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
（8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞
（1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8
分钟。
（4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
（1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后要做好标记。
（2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
5. 悬浮型细胞的传代
（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
注意事项：
1.严格的无菌操作。
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。
10磅20min高压灭菌，使用时调节PH 值到7.4。
注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。