艾叶提取物激活凝血因子Ⅻ发挥止血活血功能

Water Extract of Artemisia Argyi Arrests Hemorrhage and Invigorates Blood Circulation by Activating Coagulation Factor XII
WANG Shanshan，CHENG Shaowu，SONG Zhenyan，GONG Shengqiang，LIU Yang，GE Jinwen
Key words： Artemisia argyi； coagulation factor XII； intrinsic coagulation cascade； fibrinolysis
艾叶是菊科蒿属植物的干燥叶，辛、苦、温，中医认为艾 液凝固［4］。而艾叶中含有的萜类、黄酮类物质是艾灸与擦
叶具有理气血、温经血的作用。现代药理研究证实具有止 剂的主要药物成分，有通经活络，化瘀止血之功。为达到不
第 35 卷 第 10 期 2017 年10 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 10 Oct． 2 0 1 7
DOI： 10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2017． 10． 005
孵育 5 min，编组为艾叶低、中、高剂量组； 将 2 mg / mL 艾叶 提取液与人血浆 37 ℃ 孵育 5、15、30、45、60 min，编组为艾 叶 1、2、3、4、5 组。14 000 r / min 离心 5 min，取上清，加入 2 × SDS 上样缓冲液和 2． 5% β － ME，热水浴 5 min 后，上样 于 8 % 丙烯酰胺胶，12 μL / 孔，100V，跑胶，120 V 湿转 2 h 后，封闭 1 h，FXII 抗体 37 ℃ 孵育 2 h 后，TBST 洗膜，37 ℃ 二抗孵育 1h 后显影。 1． 2． 5 纤溶酶原激活实验 参考 FXII 激活纤溶酶原生成 实验［11］，将 10 μL 人全血浆用 10 μL PBS 稀释后分别加入 10 μL 0． 9 % 生理盐水和艾叶提取液，编组为空白组和艾叶 处理组，再将缺 FXII 血浆用 10 μL PBS 稀释后加入 10 μL 艾叶提取液，编组为缺 FXII 血浆艾叶处理组。将 3 组血浆 样本 37 ℃ 孵育 5 min 后加入纤溶酶原发色底物 S － 2251， 37 ℃ 孵育 0、15、30、45、60 min 在酶标仪上 OD405 测定吸光 值，记录读数。
研究证实艾叶中鞣酸类物质是最强的促凝成分，其中大量 当代研究证实，艾叶加热后挥发性成分含量明显降低，促凝
中 的络合基团能与血液中的金属离子产生络合作用，促进血 作用增强［5］。通过对小鼠给药前后凝血时间的比较，显示
华
中
艾叶炭可缩短小鼠的凝血时间，但就出血时间而言，艾叶生
医 药 收稿日期： 2017 － 05 － 22
学
向： 中西医结合心脑血管防治。
止血液丢失，维持血管内血液流动状态的作用。当血管壁损伤
刊
通讯作者： 葛金文（ 1964 － ） ，男，湖南双峰人，教 授，博 士，研究方
时，血管收缩，胶原暴露激活血小板，提供了凝血因子反应表
向： 中 西 医 结 合 心 脑 血 管 防 治。 E-mail： cmgjw @ tom． 面。血浆凝集分为两条通路，外源性凝血控制着止血和血管损
明，艾叶提取物可有效激活 FXII 参与到内源性凝血反应，促进血液凝固，同时可能通过调控纤溶酶原并抑制内源
性凝血wk.baidu.com下游底物参与活血过程。
关键词： 艾叶； 凝血因子 XII； 内源性凝血系统； 纤溶系统
中图分类号： Ｒ284． 2
文献标志码： A
文章编号： 1673-7717（ 2017） 10-2488-05
基金项目： 国家自然科学基金项目（ 81274008）
用、砂炒、烘 炒、醋 制 对 生 理 性 止 血 却 似 乎 没 有 太 大 影 响［6］，产生这种差异的原因目前没有定论。
作者简介： 王珊珊（ 1990 － ） ，女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方
生理性止血是指血管损伤处形成血凝块的过程，具有防
干艾叶 100 g（ 湖南中医药大学第一附属医院药房提 供） ； 缺 FXII 人血浆、APTT 试剂盒定标试剂盒、质控试剂盒 （ 113406、114145、112978、113668，STAGO，法 国） ； S － 2251 （ B － 2251，boatman，法 国） ； FXII 抗 体 （ ab1007，Abcam，英 国） ； 凝血酶（ T4648，Sigma 分装，美国） ； 多功能酶标仪（ 美 国伯腾仪器 有 限 公 司） ； STA Compact Max 全 自 动 血 凝 仪 （ 北京斯塔高诊断产品贸易有限责任公司） ； Mini － PＲOTEAN Tetra 电 泳 槽、Gel Doc XＲ + 全 自 动 成 像 系 统、PowerPacTM 基础电泳仪电源（ 美国 Bio － Ｒad 公司） 。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 血浆制备 （ 1） 动物采血： 3 周雄性新西兰白兔 10 只购买于斯莱克实验动物有限公司，（ 26 ± 2） ℃ 适应性喂 养 12 h 后，用 5 % 戊巴比妥钠，1 mL / kg 麻醉后腹主动脉采 血，全血装入 5 mL 枸橼酸钠采血管中，每管 4 mL，标号， 3000 r / min，离心 10 min 得到上清兔血浆，分装后 － 80 ℃ 保 存备用。（ 2） 人血浆标本制备： 人血来源于湖南中医药大 学第一附属医院检验科，加入枸橼酸钠活血后离心得到人 全血浆，分装后 － 80 ℃ 保存。 1． 2． 2 艾叶提取液制备 参考僵蚕注射液提取法制备艾 叶提取液［10］。酶标仪测定其中蛋白浓度为 4． 44 μg / μL， 配制成 4 μg / μL 浓度以便使用。高压蒸汽灭菌后分装入 1． 5 mL 离心管内，封口，4 ℃ 保存备用。 1． 2． 3 复钙时间测定实验 将 40 μL 兔血浆、人全血浆及 缺 FXII 血浆分别编组为空白组和艾叶处理组，加入 40 μL 艾叶提取液或 0． 9 % 生理盐水至对应组血浆中，在全自动 血凝仪 内 37 ℃ 孵 育 5 min、60 min 后，血 凝 仪 自 动 加 入 0． 025 mol / L CaCl2 并记录血浆凝固时间。 1． 2． 4 FXII 激活实验 在 20 μL 人血浆中加入 20 μL PBS 溶液稀释，再分别加入 20 μL 0． 9 % 生理盐水和高岭土溶 液孵育 37 ℃15 min，编组为空白组和阳性对照组； 将 2 mg / mL、2． 67 mg / mL、2． 86 mg / mL 艾叶提取物与人血浆 37 ℃
com。
伤，其相关因子的缺乏可导致严重的出血显型（ 血友病 A / B
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中华中医药学刊
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型） ，而内源性凝血在生理功能上目前仍未阐明清楚，其中凝 血因子 XII 可被负电荷表面激活，引起整个级联反应活化，但 FXII 的缺乏却不表现出明显的出血显型［7 －8］。有研究提到艾 叶对 FXII 存在激活效应［9］。本研究通过艾叶对 FXII 的作用 来试图阐明艾叶的止血与活血效应。 1 实验材料和方法 1． 1 实验材料
机制。结果： 艾叶提取物依赖 FXII 有效缩短血浆复钙时间，艾叶提取液直接激活凝血因子 XII（ FXII） ，且存在量
效关系。进一步对 FXIIa 下游底物检测结果显示，艾叶提取液可调控 FXIIa 激活纤溶酶原参与到纤溶反应。在
APTT 测定中，艾叶提取液对 APTT 呈时效关系，显示艾叶含药血浆 APTT 早期缩短，晚期显著延长。结论： 结果表
参考 FXII 激 活 纤 维 蛋 白 降 解 实 验［11］，将 10 μL 缺 FXII 人血浆用 50 μL PBS 稀释后加入 1U 凝血酶，37 ℃ 孵 育 30 min 后，分别加入 0． 9 % 生理盐水、艾叶提取液、高岭 土溶液，编 组 为 空 白 组、艾 叶 处 理 组、高 岭 土 组。测 得 OD405 值，记录读数设为初始值； 37 ℃ 孵育 30 min，加入乙 酸终止反应，测定 OD405 终值，记录读数变化。 1． 2． 6 部分凝血酶原活化时间测定 按制造商的说明指 示，取兔 血 浆 400 μL / 管，分 别 加 入 50、100、200、300、400 μL 艾叶提取液，用 0． 9 % NaCl 溶液作为空白对照，分别于 4 ℃ 孵育 5 min、1 h、2 h、5 h、12 h、24 h 放入血凝仪中 37 ℃ 反应。血凝仪将自动加入定量 APTT 试剂孵育 5 min 后，再 加入 CaCl2 以测定血凝时间，并记录下读数。 1． 3 统计方法
（ Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China）
Abstract： Objective： In the present study，we try to examine the effects of Artemisia argyi extract for FXII to ensure its precise mechanisms on hemorrhage and blood circulation invigorating． Methods： The study was used some experiments， including the recalcification time，Western blotting assay，the chromogenic substrate assay and the activated partial prothrombin time to ensure the function of Artemisia argyi for coagulation factor XII （ FXII） ． Ｒesults： The results showed that Artemisia argyi extract significantly reduced recalcification time，which was dependent on FXII． Meanwhile，it can directly activate FXII in a dose － effect manner． Furthermore，Artemisia argyi indirectly activated plasminogen by FXII activation． However，in the activated partial prothrombin time （ APTT） experiment，Artemisia argyi extract reduced APTT in short － time incubating with plasma and increased it in a long － time incubation． Conclusion： Artemisia argyi extract can effectively activate FXII to participate in the intrinsic coagulation activity and promote blood circulation by regulating plasminogen activity and inhibiting substrates of intrinsic coagulation cascade．
血、活血的双向调节效应［1 － 2］。研究表明这种双向调节作 同效果，中医认为不同的炮制方法可增强艾叶的某一部分
用可能与艾叶的成分密切相关。艾叶主要含有挥发油、黄 疗效。在《中药炮制经验集成》中记载“（ 艾叶） 生用温经通
酮类、鞣酸类、桉叶烷类、三萜类成分及一些微量元素［3］。 络，炒制暖 宫 安 胎，醋 制 收 敛 止 血，制 炭 散 寒 止 血 ……”。
艾叶提取物激活凝血因子 XII 发挥止血活血功能
王珊珊，成绍武，宋祯彦，龚胜强，刘洋，葛金文
（ 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）
摘 要： 目的： 通过体外实验检测艾叶提取物对 FXII 的作用，探讨了其止血与活血的作用机理。方法： 通过
运用复钙时间测定、Western Blot、发色底物法及部分凝血酶原时间（ APTT） 测定，探讨了艾叶对血浆 FXII 的作用