抗生素产生菌的分离与筛选

题目：抗生素产生菌的分离与筛选

(地衣孢杆菌产生菌的分离与筛选）

Fle－chtenstoff），但其中多为地衣所特有的有机酸类的成分特称为地衣酸。大致分为高级脂肪酸和芳香族酸。前者属于在冰岛衣中发现的原地衣甾酸（d－protolichesteric acid），约有数十种，后者是在石茸属（Gyrophora）、蓝藻衣属（CyanoPhila）等中的石茸酸，已知约有30种缩酚酸类，在睫毛苔中发现了水杨嗪酸（salazinic acid）并记载了包括水杨嗪酸在内共有12—13

种缩酚酸环醚类（depsidones）

在如粉衣科（Calliciaceae）、粉果衣科（Crpheliaceae）、茶渍科（Lecanoraceae）、猿麻桛科等中已知有数种枕酸类。其他各种石蕊属（Cladonia）的红色子器的色素红石蕊酸（rhodocladonic acid）属于蒽醌类的约有10种。地衣是藻类和菌的共生体。一般认为是以藻类的同化产物为原料由菌类制造出地衣成分。在地衣的分类中，非常重视地衣成分，通过提取出来的成分即地衣酸对各种试剂的呈色反应的有无

来鉴定其类属。

种类：

地衣酸有多种类型。从1944年开始研究地衣抗菌物质，迄今已知的地衣酸有300多种。据估计50％以上地衣种类都

松萝酸(usnic acid)、地衣硬酸(liches terinic acid)、去甲环萝酸(evernic acid)、袋衣酸(physodic acid)、小红石蕊酸(didymicacid)、绵腹衣酸(anziaicacid)、柔扁枝衣酸(divaicatic acid)、石花酸(sekikaic acid)等。这些抗菌物质对革兰阳性细菌多具抗菌活性，对于抗结核杆菌有高度活性。地衣抗菌素在德国以“EV osin I”(包括松萝酸及去甲环萝酸)，“Evosin II”〔包括松萝酸、袋衣酸及袋衣甾酸(physodalic acid)]两种产品在医疗使用；在瑞士、奥地利、芬兰、前苏联等国则以松萝酸的多种剂型作为治疗新鲜创伤以及表面化脓性伤口的有效外用抗菌素。

实验目的：

1. 明确培养基的配制原理。

2. 熟悉配制培养基的一般步骤和方法。

3. 掌握抗生素产生素的分离和筛选的原理方法。

实验原理：

芽孢杆菌能产生丁质醇，葡聚糖醇等蛋白，抗菌肽一些次级代谢产物。其产生的肽类抗生phimuniuns(Sa1)、大肠杆菌Escherichiacoli(E．coli)、如IturinA、bacillomycin、bacitracin、gramicidin、Kanosamine、GramicidinS(GS)等在些肽类抗生素主要抑制革兰氏阳性菌，有些还能抑制革兰氏阴性菌和酵母。其中有一些抗菌肽与被用于生物表面活性剂，食品防腐剂。我们利用一株对食品腐败微生物有拮抗作用的菌株进行分离鉴定.抑菌效果评价及活性物质的初步提取。

实验仪器.试剂：

土样. 有机质样品. 各种泡菜及传统型食品. 大型真菌. 各种酶产品. 植物样品。NA+青霉素纳盐；LB培养基[51；King’B 琼脂培养基嘲；BCP培养基6[1；MRS培养基。TYG培养基(蛋白胨l％、酵母浸粉0．5％、葡萄糖1％、MnSO 0．02％、琼脂20g、pH7．0)。

主要仪器设备：UNICOUV2000可见紫外分光. 光度计；EPPENDORF5414离心机；DKS一24恒温水浴锅。

实验步骤：

1 指示茵合茵平板的制备将培养24h的指示菌制成菌悬液，在600nm波长下测定OD值，将适量指示菌加入到冷却至55℃的无菌TYG培养基

中，混匀，以每皿25mL倒平皿。各指示菌加样量用加样体积mLxOD值表示(100mL培养基)：枯草芽孢杆菌为0．499；蜡状芽孢杆菌为0．52；大肠杆菌为1．56；酵母为0．96；鼠伤寒沙门氏菌1．62：金黄色葡萄球菌0．76。

2 具有抑茵活性的细菌菌株的分离用菌种

分离的材料进行分离．挑取单菌落以点样法点在含

指示菌的培养基上，30℃培养箱中培养24h，挑选有

抑菌活性的单菌落，接种于LB斜面培养基上培养

24h后于4℃冰箱中保存．备用。

4 菌株抑茵活性代谢曲线的制作以Bc为指示菌制成含菌平板。将菌株接种于含100mLTYG发酵液的500mL三角瓶中，30℃，200rm·in 发酵24h得种子液，以5％的量再次接种于含100mL TYG发酵液的500mL三角瓶中进行二级发酵，相

同条件发酵72h。每隔6h取样，600nm波长测其OD 值。经离心后取上清液做抑菌活性测定，以每个牛津杯加200 L上清液做抑菌试验。以二级发酵起始为原点，时间(h)为横坐标，抑菌圈大小(mm)及OD值大小为纵坐标，制作活性时程曲线。

1801菌株的初步鉴定

1801菌株在生长过程中产生芽孢，可判定为芽孢杆菌。该菌革兰氏染色为阳性．菌体为杆状。培养36h产生芽孢，孢子萌发时．在营养细胞的顶端到赤道

都有。孢囊无膨大，无伴孢晶体，能运动。在营养琼脂平板上，培养初期菌落上积累大量的粘液，牢固地附着在培养基上，培养后期呈裂叶状，边缘毛发状，培养3d后菌落呈褶皱垒起的山丘状。在液体培养基中静止培养形成白色菌膜。能兼性厌氧生长。