酶与酶工程(2.6)--第二章4
酶与酶工程绪论
微生物是地球上重要的可再ห้องสมุดไป่ตู้资源，有着重要的应用价值。
1.1 关于酶Enzyme
酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物分子 /蛋白质。
研究酶的结构与功能、酶的性质及作用机理对 于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义。
从酶的水平去探讨生命活动的关系，探讨酶与 代谢调节、疾病、生长发育等的关系，具有重 要的科学意义和实践意义。
天然酶在工业上应用受到限制的主要 原因有：
①大多数酶脱离其生理环境后极不稳定， 而酶在生产和应用过程中的条件往往与 其生理环境相去甚远；
②酶的分离纯化工艺复杂；
③酶制剂成本较高。
根据研究和解决上述问题的手段不同把酶 工程分为化学酶工程和生物酶工程。
化学酶工程：天然酶、化学修饰酶、固定 化酶及化学人工酶的研究和应用；
水 相 ）
非蛋白酶
印记酶(imprinting enzyme)
核酶(ribozyme, RNAzyme)
脱氧核酶(detoxribozyme, DNAzyme)
1.4 酶与酶工程的研究趋势
从发展方向分析，今后十年酶与酶工程 领域的研究热门有以下几方面：
酶结构与功能的研究 生物催化过程的研究 改造酶的催化特性及新酶设计 应用酶工程
蛋白质工程 生物催化过程的开发流程
生物催化过程又是典型的高度不均一过 程，理论上
需要特殊设计的硬件部分， 需要有高催化效率的生物催化剂， 需要实施计算机控制的软件， 需要能降低成本的回收和再利用技术，
这是生物催化过程，尤其是工业生物催 化的四个“必需”。
3、改造酶的催化特性及新酶设计
③极端环境条件下新酶的研究。
已发现的极端微生物：
能够在250~350C条件下生长的嗜热微生物， 能够在-10~0C条件下生长的嗜冷微生物， 能够在pH2.5条件下生长的嗜酸微生物， 能够在pH11条件下生长的嗜碱微生物， 能够在101.325MPa下生长的嗜压微生物， 以及在高温（105C）和高压（40.53MPa）
《酶工程》课后知识题目解析
《酶工程》课后知识题目解析第一章酶工程基础1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。
②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。
③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。
⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
2.说说酶的研究简史酶的研究简史如下：(1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科医生Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。
(3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
3.说说酶工程的发展概况I.酶工程发展如下：①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod 提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。
《酶学与酶工程》PPT课件
认为整个酶分子的天然构 象是具有刚性结构的，酶表面具有 特定的形状。酶与底物的结合如同 一把钥匙对应一把锁一样。
2、诱导契合模型(induced-fit model) 1958年由Koshland 提出。
第三个数字表示电子受体：NAD+
第四个数字表示此酶底物：乙醇。 前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性
质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用
于区分不同的底物。
二、酶的组成和结构特点
（一）酶的化学本质
酶除了少数有催化活性的RNA分子外,几乎所有的酶都是蛋白质。具 有蛋白质的典型性质。同时具有自身的特性。
亲水基团在外表,而疏水基团向内。
三、酶的作用机制
（一）结合部位 Binding site
酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。
（二）催化部位 catalytic site
酶分子中 促使底物发生化 学变化的部位称 为催化部位。
酶的活性中心的概念
通常将酶的结合部位和催化部位总 称为酶的活性部位或活性中心。 ✓ 结合部位决定酶的专一性， ✓ 催化部位决定酶所催化反应的性质。
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酶工程课后题答案.doc
第一章1.简述酶与一般催化剂的共性以及作为生物催化剂的特点共同点：只能催化热力学所允许的的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点：反应前后酶本身没有质和量的改变：很少量就能发挥较大的催化作用：其作用机理都在于降低了反应的活化能。
酶作为生物催化剂的特点：1.极高的催化率；2.高度专一性；3.酶活的可调节性；酶的不稳定性。
5.酶失活的因素和机理。
酶失活的因素主要包括物理因素，化学因素和生物因素物理因素1热失活：热失活是由于热伸展作用使酶的反应基团和疏水区域暴露，促使蛋白质聚合。
2冷冻和脱水：很多变构酶在温度降低是会产生构象变化。
在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变，很容易引起蛋白质的酸变性。
3.辐射作用：电离辐射和非电离辐射都会导致多肽链的断裂和酶活性丧失。
4.机械力作用：化学因素1.极端pH：极端pH远离蛋白质的等电点，酶蛋白相同电荷间的静电斥力会导致蛋白肽链伸展，埋藏在酶蛋白内部非电离残基发生电离，启动改变。
交联或破坏氨基酸的化学反应，结果引起不可逆失活。
极端pH也容易导致蛋白质水解。
2.氧化作用：酶分子中所含的带芳香族侧链的氨基酸以及Met, Cys等，与活性氧有极高的反应性，极易受到氧化攻击。
3.聚合作用：加热或高浓度电介质课破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，促使蛋白质结构发生改变，分子间聚合并沉淀。
4.表面活性剂和变性剂：表面活性剂主要改变酶分子正常的折叠，暴露酶分子疏水内核的疏水基团，使之变性；变性剂与酶分子结合，改变其稳定性，使之发生变性。
生物因素微生物或蛋白水解酶的作用使酶分子被水解。
6.简述酶活力测定方法的原理直接测定法：有些酶促反应进行一段时间后，酶底物或产物的变量可直接检测。
间接测定法：有些酶促反应的底物或产物不易直接检测，一次必须与特定的化学试剂反应，形成稳定的可检测物。
酶偶联测定法：与间接测定法相类似，只是使用一指示酶，使第一酶的产物在指示酶的作用下转变成可测定的新产物。
酶学与酶工程重点总结
酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。
2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。
（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。
（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。
（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。
（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。
5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。
如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。
因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。
4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。
酶学与酶工程 (2)优秀课件
（二）国际系统命名法
国际系统命名法原则是以酶的整体反应为基 础的，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物 及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起 反应，应在它们系统名称中包括两个底物的名 称，并以“：”号将它们隔开。若底物之一是水 时，可将水略去不写。
ATP＋D-葡萄糖 ADP＋D-葡萄糖-6-磷酸 国际系统命名为： ATP：D-葡萄糖磷酸转移酶
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2． 酶与底物的结合模型
a． 锁和钥匙模型 b ．诱导锲合模型
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a． 锁和钥匙模型
认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结 构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的 结合如同一把钥匙对一把锁一样
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b ．诱导锲合模型
该学说认为酶表面并没有一种与底物互补 的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成 了互补形状.
专一性
活性部位
必需基团
催化基团 催化性质
维持酶的空间结构
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三．酶的作用机制
1． 酶的作用过程 2． 酶与底物的结合模型 3 ．酶的催化作用
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1． 酶的作用过程
酶的活性部位：
是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个 酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很 远的氨基酸残基形成的三维实体。
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（三）国际系统分类法及酶的编号
国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类型， 把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解 酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别用1、2、 3、4、5、6来表示。再根据底物中被作用的基团或 键的特点将每一大类分为若干个亚类，每一个亚类又 按顺序编成1、2、3、4……等数字。每一个亚类可 再分为亚亚类，仍用1、2、3、4……编号。每一个 酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“·”隔开，编 号之前冠以EC（Enzyme Commision)。
酶工程考试重点
第一章：绪论◆酶：由生物体产生的具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可以分为蛋白类酶（protein enzyme)和核酸类酶◆酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程◆锁与钥匙学说：底物结构必须与酶活性部位的结构非常互补，就像锁与钥匙一样，这样才能紧密结合，形成酶-底物复合物。
这个学说可以解释酶的绝对专一性，但是不能解释酶的相对专一性。
◆诱导契合理论：酶分子活性中心的结构并不与底物分子的结构互补,但活性中心有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性中心的各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向，从而使酶与底物互补结合，产生酶-底物复合物，并使底物发生化学反应◆中间产物学说：酶首先与底物结合成酶-底物复合物，然后转变成酶-过渡态中间物复合物，然后，生成酶-产物复合物，最后从酶分子上释放产物，从而大大降低反应的活化能（分子由基态转变为过渡态即活化态所需的能量）。
◆Km 值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度◆竞争性抑制：抑制剂竞争性与酶的活性中心结合，从而阻止底物与酶的结合。
这是最常见的一种可逆抑制作用。
随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。
Vm 不变，Km 增大◆非竞争性抑制：底物和抑制剂可以同时与酶结合，抑制剂结合于活性中心以外的部位，两者没有竞争作用，但影响产物的释放，Vm 降低，Km 不变◆反竞争性抑制Vm 降低，Km 减小◆酶活力：酶催化底物发生化学反应的能力。
测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。
酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。
◆酶的比活力：每毫克酶蛋白（酶制剂）所含的酶活力单位数称为酶的比活力，用U／mg 蛋白表示。
酶的比活力是酶制剂的一个纯度指标。
对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶纯度愈高。
◆酶的生产方法：.提取分离法；生物合成法；化学合成法第二章：微生物发酵产酶结构基因、操纵基因与启动基因一起组成操纵子，分为诱导型与阻遏型。
酶工程 第二章酶动力学 第二节影响酶促反应的因素
第二节 影响酶促反应的因素
酶的最适pH并不是一个常数，它往往因酶的纯度、底物种 类和浓度以及环境介质的成分不同而不同。因此，酶的最适pH 只在一定的条件下才有意义。大多数酶的最适pH在6～8之间， 动物酶多在6.5～8.0之间，植物和微生物酶多在4.5～6.5之间。 也有少数例外，如胃蛋白酶为1.5，肝脏中的精氨酸酶则为9.7。 几种常见酶的最适pH见表2-1。
pH对酶活性产生影响的原因存在以下几方面的可能：
1.氢离子与氢氧根离子的浓度会影响到酶蛋白构象的变化， 甚至能够导致酶变性而失活。
2.pH能够影响到酶分子中某些基团的解离，这些基团的离 子化状态与酶分子的活性中心构象有关。
第二节 影响酶促反应的因素
3.pH会影响到底物分子的解离状态，同时也会影响酶分子 的解离状态，从而对酶与底物的亲和力产生影响。
所示。
[s]
图2-6 底物浓度与酶反应速度的关系
第二节 影响酶促反应的因素
从上图可以看出，在低的底物浓度时，底物浓度增加，反 应速度随之急剧增加，反应速度与底物浓度成正比，此时米氏 方程可简化为
当底物浓度较高时，增加底物浓度，反应速度虽随之增 加，但增加的程度不与底物浓度成正比；当底物达到一定浓 度后，若再增加其浓度，则反应速度将趋于恒定（v= Vmax）， 并不再受底物浓度的影响，此时的底物浓度巳达到饱和程度。 所有的酶都有这种饱和现象，但各自达到饱和时所需要的底 物浓度各不相同，甚至差异极大。
第二节 影响酶促反应的因素
竞争性抑制作用可以通过增加底物的浓度来加以解除。这
种 米抑氏制常作数用Km的增特大点（是如酶图催2-化10反）应。的最大反应速度Vmax不变，而
图2-10 竞争性抑制作用的特性
《酶工程》复习大纲答案详解
《酶⼯程》复习⼤纲答案详解《酶⼯程》复习⼤纲试题题型：名词解释，判断题，选择题，简答题，论述题，实验设计题。
第⼀章酶⼯程基础⼀、名词解释：酶：指⽣物体产⽣的具有催化活性的⽣物⼤分⼦。
酶⼯程：由酶学与化学⼯程技术、基因⼯程技术、微⽣物学技术相结合⽽产⽣的⼀门新技术，是⼯业上有⽬的地设计⼀定的反应器和反应条件，利⽤酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，⽣产⼈类所需产品或服务于其它⽬的地⼀门应⽤技术。
转换数：酶使底物每分钟变化的分⼦数。
催化周期：单位时间内每个酶分⼦将底物分⼦转换成产物的最⼤值，即每摩尔酶单位时间催化底物转化为产物的摩尔数。
酶活⼒：也称为酶活性，是指酶催化某⼀化学反应的能⼒。
其⼤⼩可⽤在⼀定条件下，酶催化某⼀化学反应的速度来表⽰，酶催化反应速度愈⼤，酶活⼒愈⾼。
⽐活⼒：指在特定条件下，单位质量的蛋⽩质或RNA所拥有的酶活⼒单位数。
酶活国际单位IU: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1µmol底物或催化1µmol产物形成所需要的酶量为1个酶活⼒单位，即为国际单位（IU）。
催量kat：每秒钟转化 1 摩尔底物（被反应物）所需的酶活⼒为1个katal ,简称 kat⼆、问答题1、酶催化的特点有哪些？⾼效性：酶的催化效率⽐⽆机催化剂更⾼,使得反应速率更快；专⼀性：⼀种酶只能催化⼀种或⼀类底物,如蛋⽩酶只能催化蛋⽩质⽔解成多肽、⼆肽酶可催化各种氨基酸脱⽔缩合形成的⼆肽；温和性：是指酶所催化的化学反应⼀般是在较温和的条件下进⾏的.活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等. 有些酶的催化性与辅因⼦有关.易变性：由于⼤多数酶是蛋⽩质,因⽽会被⾼温、强酸、强碱等破坏2、影响酶催化作⽤的因素有哪些？◇1温度：酶促反应在⼀定温度范围内反应速度随温度的升⾼⽽加快；但当温度升⾼到⼀定限度时，酶促反应速度不仅不再加快反⽽随着温度的升⾼⽽下降。
酶工程教学大纲
《酶工程》课程教学大纲总学时数：30一、课程的地位、性质和任务酶工程（enzyme engneering）是生物技术专业的主干必修课，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术，在生物技术人才培养中处于至关重要的地位。
它涉及细胞工程、基因工程、发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的分子工程。
学生通过酶工程的学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。
二、课程教学的基本要求学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术、酶的分离纯化、固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用，进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。
本课程理论课30学时，于本科三年级第二学期开设。
讲授方式：1．讲授2．利用CAI课件三、各章主要内容、学时分配及教学要求第一章绪论 2学时【单元目标】1．了解酶工程的研究意义；2．掌握酶工程的概念及研究内容。
【授课内容】一．酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史（二）酶工程研究简史二. 酶工程简介1.酶工程2.组成3.分类第二章微生物发酵产酶 4学时【单元目标】1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制2.了解产酶微生物的分离和选育方法3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription) （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 1．翻译2．翻译过程即蛋白质的合成过程二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论（二）酶合成调节的类型1.诱导 (induction)2.阻遏 (repression)（三）酶合成的调节机制三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种2.基因工程育种（二）条件控制第二节酶发酵动力学一、细胞生长动力学（Monod方程）二、产酶动力学(一) 酶生物合成的模式1.生长偶联型2.部分生长偶联型3.非生长偶联型(二) 产酶动力学第三节微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离和选育二、微生物发酵产酶方法1.固体培养2.液体培养3.固定化细胞三、微生物酶的类型1.胞外酶2.胞内酶第三章动、植物细胞培养产酶2学时一、动植物细胞与微生物细胞主要特性差异二、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点、提取法缺点2.培养基特点3.培养方法4.培养条件的影响与控制5.植物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点2.培养基3.培养方法4.培养条件的影响与控制第四章酶的提取与分离纯化 12学时【单元目标】1．掌握酶分离纯化的常用方法及其原理2．掌握几种常用的电泳方法及操作步骤2．了解酶的纯化方案的设计【授课内容】第一节酶的分离4学时一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化(二)发酵液的固液分离二、细胞破碎（一）细胞壁组成（二）细胞破碎的方法（三）细胞破碎确认三、酶的提取(extraction)（一）理想提取液具备的条件、目标原则（二）提取方法四、离心分离（一）基本原理（二）离心机的种类（三）常用离心方法1．差速离心2．密度梯度离心3. 等密度梯度离心又称沉降平衡离心（四）应用五、沉淀分离（根据溶解度的不同）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) （四）有机聚合物沉淀法（五）选择性变性沉淀法六、萃取（extraction）分离（一）溶剂萃取法（二）双水相萃取技术（三）超临界流体萃取（四）反胶团萃取第二节酶的精制5学时一、膜分离技术（一）扩散膜分离（二）加压膜分离（三）电场膜分离二、层析法（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理2.吸附剂3.洗脱剂4.应用（二）凝胶过滤层析)(gel filtration chromatography)1.基本原理2.凝胶的种类和性质3.操作4.应用（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1. 原理2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程3. 操作4. 应用- 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（hydrophobic interaction）1、原理2. 吸附剂3. 操作4. 应用（五）亲和层析(affinity chromatography)1. 原理2. 基质的选择3. 配体的选择4. 偶联（亲和吸附剂的制备）5. 操作及应用(六) 高效（压）液相层析（HPLC：high performance（pressure）liquid chromatography)1. 基本原理2. 分类3. 色谱仪组成第三节电泳一、电泳的基本理论1. 原理2. 电泳的分类3. 电泳常用设备二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1.原理2.分离效应三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 原理2. 操作四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )1. 原理2. 操作3. 应用第四节酶的浓缩、干燥与结晶2学时一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩(二)超滤浓缩(三)吸水剂(四)反复冻融浓缩(五)沉淀法二、酶的干燥三、酶的结晶（一）结晶的条件（二）结晶的方法第五节纯化方案的设计与评价１学时一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（二）纯化方法的排序二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（二）蛋白质浓度测定（三）提纯倍数与回收率第五章酶分子的化学修饰 2学时【单元目标】1．掌握酶活性中心的概念及共性2．了解酶化学修饰的目的及原理3．了解酶化学修饰的种类及应用【授课内容】第一节酶的活性中心一、活性中心的概念二、活性中心的共性三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法2.化学修饰法3.蛋白质工程第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因2.改变酶特性有两种主要的方法3.酶化学修饰的概念二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第四节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性二、修饰剂的选择三、反应条件的选择第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）1．定义2．修饰剂3．应用（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1．定义2．侧链基团修饰剂3．几种重要的修饰反应（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰第六章酶与细胞的固定化 2学时【单元目标】1．掌握固定化酶和固定化细胞的定义及特点2．了解固定化酶和固定化细胞的性质及应用【授课内容】第一节酶与细胞的固定化一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶 (immobilized enzyme)2.固定化细胞（immobilized cell）二、固定化方法（一）酶的固定化方法1.吸附法（adsorption）2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）3.交联法（crosslinking）4.包埋法(encapsulation)（二）各种固定化方法的优缺点比较（三）细胞的固定化方法1.固定化细胞的分类2.固定化方法（四）原生质体的固定化方法第二节固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质二、固定化细胞的性质三、固定化酶（细胞）的评价指标第三节固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1．氨基酰化酶（Aminoacylase）2．葡萄糖异构酶二、固定化酶在医学上的应用1．消血栓2. 人工肾三、在分析检测中的应用1. 酶传感器1）酶传感器的原理2）酶传感器的应用2. 酶联免疫测定第七章酶反应器 2学时【单元目标】1．了解酶反应器的几种类型2．了解酶反应器的设计原理及操作【授课内容】第一节酶反应器的特点与类型一、酶反应器的类型（一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ）（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR)（四）膜式反应器(Membrane Reactor)（五）鼓泡塔型反应器二、酶反应器的发展第二节酶反应器的设计与选择一、酶反应器的设计1.设计目的2.设计原理（依据）二、酶反应器的选择（一）酶的应用形式（二）底物的物理性质（三）反应操作要求（四）酶的稳定性（五）应用的可塑性及成本三、酶反应器的操作第八章酶的应用 4学时【单元目标】1．了解酶在医药方面的应用2．了解酶在食品方面的应用3．了解酶在化工方面的应用4. 了解酶在环境保护方面的应用5. 了解酶在生物技术领域的应用【授课内容】第一节酶在医药方面的应用第二节酶在食品方面的应用第三节酶在化工方面的应用第四节酶在环境保护方面的应用第五节酶在生物技术领域的应用四、使用教材与主要参考书目录1教材《酶工程》（第二版）作者：郭勇科学出版社 20042 主要参考书目郭勇现代生化技术，华南理工大学出版社， 1996郭勇酶的生产与应用，化学工业出版社个，2003罗贵民酶工程，化学工业出版社，2002张树政酶制剂工业，科学出版社，1984邹国林酶学，武汉大学出版社， 1997五、考核方法和成绩构成本课程为考试考核，包括两部分：期中及平时为30%，期末70%。
第二章 酶学与酶工程 (4-6节)
一 竞争性抑制作用
1.竞争性抑制作用的含义 2. 竞争性抑制作用的机理 3. 竞争性抑制作用举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
1.竞争性抑制作用的含义
退出
2. 竞争性抑制作用的机理
竞争性抑制的机理
1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而
Enzyme Engineering 酶工程
退出
第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第二节 酶作为催化剂的显著特点 第三节 酶抑制作用的概念和分类 第四节 可逆抑制作用 第五节 不可逆抑制作用 第六节 酶抑制剂的应用
退出
第四节 可逆抑制作用
一 竞争性抑制作用 二 反竞争性抑制 三 非竞争性 三 其他可逆抑制
图 1.1 传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Figure 1.1. An overview of the traditional, chemical synthesis of β-lactam
退出
antibiotics
酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Fermentation
NH2 COOH
N
H
S
the B chain (blue)。 退出 （Duggleby, H.J. Nature, 1995, (373):264-268）.
青霉素酰化酶的结构
不同来源的青霉素酰化酶都有α，β两个亚基组成，α亚基 的分子量在24k左右，β亚基的分子量在65k左右。
E. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846 个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号 肽，209个氨基酸组成的α亚基，54个氨基酸组成的连接 肽和557个氨基酸组成的β亚基。
农学第二节酶学与酶工程
h
39
2.抑制程度的表示
一般用反应速度的变化来表示。若 以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入 抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制 程度有下列几种表示方法：
h
40
2.抑制程度的表示：
相对活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo 相对活力百分数（残余活力百分数） a%==Vi/Vo*100% 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%
核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA， 能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反 应。
h
10
酶用于生物催化的概况
类别
水解酶 hydrolases
氧化还原酶 oxidoreductases 转移酶 transferases
裂合酶 lyases 异构酶 isomerases
连接酶 ligases
h
23
b. 共价催化
亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和 电子的原子中心。 亲核试剂：就是一种试剂具有强烈 供给电子的原子中心。
h
24
c. 邻近效应及定向效应
所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶 的催化基团越靠近，其反应速度越快。
h
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d. 变形或张力
h
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e. 酶的活性中心为疏水区域
酶的活性中心为酶分子的凹穴 此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基
h
6
（4）裂合酶(Lyase)
这类酶可脱去底物上某一基团留下双键， 或可相反地在双键处加入某一基团。
H O O C C H = C H C O O H H 2 OH O O C C H 2 C H C O O H O H
酶工程2-4 酶发酵动力学
生长偶联型
dE X dt
部分生长偶联型 非生长偶联型
dE X X dt
dE X dt
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞又称为固定化活细胞或固定化增 殖细胞, 是指采用各种方法固定在载体上, 在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代 谢的细胞。
固定化细胞是在20 世纪70 年代后期才发展 起来的技术。
固定化微生物细胞发酵产酶自1978 年开始研 究以来, 取得可喜进展。
一、固定化细胞发酵产酶的特点
1. 提高产酶率
细胞经过固定化后, 在一定的空间范围内 生长繁殖, 细胞密度增大, 因而使生化反应加速, 从而提高酶产率。
2. 可以反复使用或连续使用较长时间
固定化细胞固定在载体上, 不容易脱落流失, 所以 固定化细胞可以进行半连续发酵, 反复使用多次;
在连续全混流反应器的发酵过程中，不断流加培养液并 不断地排出同体积发酵液。在稳态时，游离细胞连续发 酵的生长动力学方程可表达为：
D —— 稀释率,是指单位时间内,流加的培养液与发酵容器中发酵 液体积之比,一般以h-1为单位。
稀释率可以在0 与μm 之间变动
当D = 0 的时候, 为分批发酵; 当D <μ时, d X/ d t 为正值, 表明发酵液中细胞浓度不断增 加, 随着细胞浓度增加, 限制性基质的浓度相对降低, 使比生 长速率减小, 在比生长速率降低到与稀释速率相等的时候, 重 新达到稳态; 当D =μ时, d X/ d t 为0, 发酵液中细胞浓度保持恒定不变; 当D >μ时, d X/ d t 为负值, 发酵液中的细胞浓度不断降低, 随着 细胞浓度降低, 限制性基质的浓度相对升高, 使比生长速率增 大, 在比生长速率提升到与稀释率相同时, 建立新的平衡, 重 新达到稳态; 而当D >μm 时, 细胞浓度趋向于零, 无法达到新的稳态。
酶工程((复习资料)
第一章绪论一.1 酶的变性与失活失活作用：凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
2 酶的回收率与纯化比3 酶的结合效率及酶活力回收率酶的结合效率又称酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率酶的结合效率=（加入的总酶活力-未结合的酶活力）/加入的总酶活力*100%酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率酶活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力*100%4 底物抑制及其产生的三个原因（1）、竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。
当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了（2）、非竟争性抑制酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。
（3）、反竞争性抑制作用酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。
二.1 什么是酶工程?酶工程(Enzyme Engineering))又称为酶技术，是指酶的生产与应用的技术过程。
是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合起来利用酶的催化作用进行物质转化的技术它是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学。
就酶工程本身的发展来说，包括下列主要内容：酶的产生、酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、有机介质中的酶反应、酶传感器、酶反应器、抗体酶、人工酶和模拟酶2 什么是酶的最适PH及其影响酶的反应机理在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH(optimum pH)。
a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。
b.影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基团）c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行3 简述酶活力的测定方法（要求：快速，两个阶段，四个步骤）要求：快速、简便、准确两个阶段：酶在一定条件下与底物反应一段时间然后再测定反应物中底物或产物的浓度变化量。
酶工程 第二章酶动力学 第一节酶促反应动力学
1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten） 在前人工作的基础上，通过大量的定量研究，提出了酶促动力 学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方程，推导过程如下：
根据上述反应式，中间产物ES的生成速度(底物S的消失速度)
v1＝k1[S][E]－k2[ES]
（2-1）
而ES的消失速度(产物P的生成速度) v2＝k3 [ES]，当反应达到 平衡时，即v1＝v2时
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下， 反应速度（v）直接与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下， 速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速度与底物浓度[S]无关 （如图2-1）。
图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系
第一节 酶促反应动力学
图2-5 乒乓反应机理 实际上，多底物酶促反应动力学是非常复杂的，以上只是作以简要介绍， 有关详细内容，可查阅相关专著。
将米氏方程改写成以下形式
以 对作图，绘出曲线，横轴截距即为－值，纵轴截距则是 （图2-2）。
第一节 酶促反应动力学
图2-2 双倒数作图
第一节 酶促反应动力学
二、多底物动力学 通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。 现在我们考虑一个涉及两种底物和两种产物的酶促反应物反应。现在已知的生化反应 中有六成以上属于这一种反应。双底物反应的机理有下面三种 可能：
第一节 酶促反应动力学
1.有序反应机理(ordered reaction) 这种情况下，A和B分别可被说成是先导底物和后随底物，Q 是A的产物，最后被释放。A和Q竞争同游离酶E结合，但A和B则 不会（或者Q和B也不会）发生竞争（如图2-3）。依赖烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸（NAD＋或NADP＋）的脱氢酶的反应就属于这种类型。
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1、假定一种酶只有当某一特定的组氨酸残基侧链未被质子化时，酶分子才具有活性，降低pH对于该酶会发生哪一种抑制？（ ）
A 反竞争性 B 非竞争性 C 竞争性 D 混合型
答案B
2、用0.5-2.0 nm长的双功能交联剂固定酶分子上的两个基团，能交联上说明距离在此范围内反之不能判断。
（ ）
答案∨
3、载体带负电荷，底物也带负电荷，固定化后下述正确的是（）
A最适pH向酸性方向移动，Km’>Km
B最适pH向酸性方向移动，Km’<Km
C最适pH向碱性方向移动，Km’>Km
D 最适pH向碱性方向移动，Km’<Km
答案C
4、下列关于固定化后酶Km变化论述正确的是（）
A[Si]＜[S],ρ＞1,km’＜km B[Si]＜[S],ρ＞1,km’＞km
C[Si]＜[S],ρ＜1,km’＞km D[Si] ＞[S],ρ＞1,km’＞km
答案C。