CaCl2法制备感受态

准备：

1，1L或0.5L大三角瓶（氧气充分，利于细菌生长），装入100mlLB液体培养基培养基中加100ul 4MNaOH

2，50ml干净（最好较新）塑料离心管

3，1ml枪头和200ul枪头足够数量

4，足够数量的分装用1.5mlEp管

5，80mMMgCl2+20mMCaCl2

以上灭菌，1室温放置，2-5冷冻储藏

制备：

1，活化菌种，5mlLB不加抗生素，1：100接菌，37度振荡培养过夜，同时接一管加抗生素的看是否长菌（让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞）

1：500-1000转接入100ml培养基中，培养2-3h（减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。）

2，无菌台中将菌液转移到冰预冷的50ml离心管中，冰浴10’，4度4000rpm 10’，超净台中弃上清，（使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡）

3，用10ml冰预冷的5液体重悬100ml菌液所得菌体（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱），冰浴10’（细菌处于00C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA，经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。）

4，4度4000rpm 10’收菌

每100ml菌体用4ml冰预冷的0.1MCaCl2+10%甘油重悬（除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）

5，）

6，4度放置5hr

7，分装100ul/冰预冷的1.5EP，-80度保存

8，取两支分别转质粒和不转验证