CaCl2法制备感受态
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
1. 2酶与试剂
限制性内切酶BamH I, SalI, H ind Ë , EcoR I及T4DNA连接酶均购自Boeh ringermannhein等公司。Taq DNA聚合酶及PCR反应缓冲液为中科院微生物所田颖川先生实验室自制。
1. 3PCR引物
检测B21, 32葡聚糖酶基因的两个引物为: 5 ’端引物: 5’2 GCGGA TCCGACCA TGGCTGCTA TCACACTCC23’; 3’端引物: 5’2 CGGTCGACC TCACA TCTCACTTACGA GA 23’。此引物由上海生物工程有限公司合成。
Ca2处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2、Co2）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；⏹ 3、培养物于冰上放置20min；⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
CaCl2法制备感受态细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
CaCl2法制备感受态细胞知识讲解
C a C l2法制备感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
大肠杆菌感受态的制备-CaCl2法
大肠杆菌感受态的制备一、准备材料：缓冲液和溶液：CaCl2·2H2O:贮存液浓度为1M，使用浓度0.1M；使用时取10mL加90mL水稀释至100mL；另含15%甘油的0.1MCaCl2也需要配。
MgCl2·6H2O:贮存液浓度为1M，使用浓度0.1M；使用时取10mL加90mL水稀释至100mL。
以上溶液经0.22μm滤膜过滤除菌。
培养基：(新鲜配置)LB:1%蛋白胨(W/V)，0.5%酵母提取物(W/V)，1% NaCl(W/V)；固体培养基加入1.5%琼脂(粉)。
高压灭菌。
仪器和材料：离心机，制冰机，水浴锅；50mL聚丙烯离心管(预冷)等。
——————————————————————————————————方法：(相关操作需在无菌工作台冰上进行)(1). 将于-80℃冰箱保存的DH5α(或其他)菌株，在LB无抗生素平板上划线，37℃培养直至长出单菌落,一般生长16～20h,菌落直径1-2mm。
(2). 挑取单菌落，接种于于含20ml 新配置LB培养液的100mL三角瓶中，37℃培养至OD值0.8-1.6(确保细菌处于对数期，保证其活力)。
(3). 将过夜培养菌液按照0.5-%~1%体积比接种于于含100ml 新LB培养液的500或1L三角瓶中，37℃220rpm培养1～3小时至OD600=0.4-0.6，0.35的时候就可以收取。
(转速不宜高，200-220rpm)(4). 将CaCl2-MgCl2、CaCl2溶液，50mL离心管放在冰浴上预冷。
(5). 时间到，将培养液冰浴10min，分装于两个50mL遇冷的离心管，4℃4000rpm (或者3000g)离心10min，收集菌体，去除上清(倒置扣干1min，以使最后痕量培养液流尽)。
(6). 向离心管中加入20ml冰冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mM MgCl2, 20mM CaCl2)，先后吹吸重悬两个离心管中的菌体最终合并到同一管中。
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
CaCl2法制备感受态细胞
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞
1、挑取37℃培养16—20h的单菌落（直径2—3mm）于含有100mlLB或SOB 的500或1000ml的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2—0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD值为0.2—0.4时，约含109个菌/ml；
2、转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；
3、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
4、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
5、用30ml冰冷MgCl
2—CaCl
2
溶液（80mMMgCl
2
和20mMCaCl
2
）漩涡振荡重悬
菌体沉淀，置于冰上10min；
6、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
7、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
8、用2ml冰冷0.1MCaCl
2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl
2
/50ml原初培养物）漩涡
振荡重悬菌体沉淀；
9、放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%，分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
大肠杆菌感受态细胞制备
E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。
二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。
注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。
三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。
此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。
四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。
转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。
在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。
注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。
培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。
五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。
2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。
3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。
氯化钙法制备感受态
氯化钙法制备感受态一、我制氯化钙法感受态的步骤：二、1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm过夜培养；三、2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm培养2.5 h（OD600nm介于0.4-0.5）；四、3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；五、4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；六、5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。
七、八、需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。
九、另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。
十、十一、热激法转化大肠杆菌十二、1) 将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；十三、2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；十四、3) 加入895 μl（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的）LB液体培养基，37 ℃水浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm 内，太快了容易让质粒丢失）；十五、4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十六、6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（~200 μl）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十七、7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
1.CaCl2法制备感受态细胞(分子克隆)
2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态
CaCl2法制备大肠杆菌感受态转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
一. 材料E. c oli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。
二. 试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。
2.Amp母液：配方见第一章。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
E.coli感受态细胞的制备(CaCl2法)
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用4ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
CaCl2法制备感受态细胞
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
(先用3ml的F1振荡悬浮再加入剩下的12ml)5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用2ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
20CaCl2法感受态制备
CaCl2法感受态制备
实验准备：灭菌0.1M CaCl2溶液(0.05mol/L CaCl2也可以)、含40%灭菌甘油，灭菌50mL离心管
实验步骤（以下提到的LB培养基均含有对应抗生素）
1.菌种的活化：以感受态细胞在LB的平板上进行划线分离。
2.菌种的前培养：从LB平板上挑取单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，37℃振荡
培养过夜至对数生长中后期。
3.菌种的准备：将该菌悬液以1:100的比例分别接种于100mlLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。
5.感受态细胞的制备：
①把上述的锥形瓶放到冰水浴20min使其冷却。
把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
②弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
③弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用移液枪轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
④弃去上清液，加入1.5mL 0.1M CaCl2溶液，1.5mL 40%甘油，用移液枪轻轻吹打
使沉淀混匀，并分装到灭菌1.5mL离心管，放置在冰盒上。
⑤准备好液氮盒子，在冰盒上摆放好0.5ml离心管，将感受态细胞悬液分装成100µl
或200µl每管。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。
化学转化感受态制备
化学转化感受态制备化学转化感受态制备是分子生物学中常用的一种技术，通过此方法可以有效地将外源DNA引入到细胞内。
本文将详细介绍化学转化感受态制备的过程及相关注意事项。
一、化学转化感受态制备原理化学转化感受态制备是利用化学物质（如CaCl2）处理细胞，使其处于一种能高效吸收外源DNA的状态。
在这个过程中，细胞膜会发生改变，使得DNA能够更容易地通过细胞膜进入细胞内。
二、化学转化感受态制备步骤1.细胞培养：选取合适的宿主细胞，进行传代培养，使细胞处于对数生长期。
2.收集细胞：将对数生长期的细胞用离心机收集，弃去培养液。
3.洗涤细胞：用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养液。
4.重悬细胞：用适量的CaCl2溶液重悬洗涤后的细胞。
5.加入DNA：将待转化的DNA加入细胞悬液中，轻轻混匀。
6.化学转化：将细胞-DNA混合液置于冰浴中30分钟，使细胞充分吸收DNA。
7.恢复细胞生长：将化学转化后的细胞用预冷的PBS洗涤2次，然后加入新鲜培养液，恢复细胞生长。
三、注意事项1.选择合适的宿主细胞：不同的宿主细胞对化学转化的敏感性不同，需根据实验需求选择合适的宿主细胞。
2.细胞状态：进行化学转化时，细胞应处于对数生长期，此时细胞活力强，转化效率高。
3.DNA质量：使用高质量的DNA进行化学转化，可以提高转化效率。
4.温度控制：化学转化过程中，温度应严格控制在0-4℃，避免细胞受损。
5.转化后培养：化学转化后，需用新鲜培养液恢复细胞生长，以提高转化效率。
四、总结化学转化感受态制备是一种简单、高效的分子生物学技术，通过掌握该技术，研究者可以成功地将外源DNA引入到宿主细胞中，为后续实验奠定基础。
（注：本文仅作为学术交流，禁止用于商业用途。
CaCl2法制备感受态细胞-1
CaCl2法制备感受态细胞1）从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到10ml的LB培养基中于37℃过夜培养2）吸取500μl上述过夜培养的新鲜菌液，接种到一个盛有50ml LB的锥形瓶中，在37℃，200rpm条件下振荡培养直至菌浓度达到5×107个/ml，对大多数大肠杆菌菌株来说这时的OD600值为0.4~0.5。
一般从转接到达到此OD值约需2.5―3小时。
3）将培养液转至一灭菌并已预冷的50ml离心管（聚丙烯管）中于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
4）然后于4℃以3000 rpm离心10min沉淀细胞，小心地弃去上清液，并倒转管子将残余的液体沥干。
5）将细胞悬浮在10ml冷的0.1mol/lCaCl2中，置冰上10min。
重复第4步操作，以沉淀菌体细胞。
6）收集菌体，加入1.5ml预冷的0.1mol/lCaCl2,小心悬浮，分装于200ul/管，若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为10%的灭菌甘油，置于-70℃保存小刚论文：大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备挑取新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；培养物按1%接种量接种于100ml LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5。
培养物冰上放置10分钟，然后于4℃，4000r/min 离心收集菌体（无菌离心管）；将菌体用10ml冰冷的0.1M CaCl2洗一次；4℃，4000r/min 离心收集菌体，用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min；4℃，4000r/min 离心收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液，即制备成大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
质粒转化过程操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5 10min。
（3）加入5–10 μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上30min。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测
大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测实验目的学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
实验原理用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。
实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.低温离心机5.微量取液器（二）材料大肠杆菌DH5α。
（三）试剂1.LB液体培养基（1升/组）胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 gNaCl 10 g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。
LB固体培养基（1升/组）在上述LB液体培养基（1升）中加入琼脂粉15g。
2.0.1mol/L CaCl2溶液，高压蒸汽灭菌。
实验步骤1.挑取大肠杆菌DH5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养12h。
2.取2ml菌液加入50ml LB液体培养基中,扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。
3.菌液放置在冰上30min，无菌条件下倒入50ml Beckman离心管中，4℃，3,500rpm离心5min。
4.弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。
冰上放置15min。
5.4℃，3,500rpm离心5min。
6.弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200μl/份分装到预冷的无菌Eppendorf管中，4℃保存备用，在一周内转化率基本不降低；如加入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年。
7.制备的大肠杆菌感受态的活性可通过实验七“质粒的转化”进行验证，转化效率高表明则表明制备的感受态活性高。
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准备：
1，1L或0.5L大三角瓶（氧气充分，利于细菌生长），装入100mlLB液体培养基培养基中加100ul 4MNaOH
2，50ml干净（最好较新）塑料离心管
3，1ml枪头和200ul枪头足够数量
4，足够数量的分装用1.5mlEp管
5，80mMMgCl2+20mMCaCl2
以上灭菌，1室温放置，2-5冷冻储藏
制备：
1，活化菌种，5mlLB不加抗生素，1：100接菌，37度振荡培养过夜，同时接一管加抗生素的看是否长菌（让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞）
1：500-1000转接入100ml培养基中，培养2-3h（减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
）
2，无菌台中将菌液转移到冰预冷的50ml离心管中，冰浴10’，4度4000rpm 10’，超净台中弃上清，（使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡）
3，用10ml冰预冷的5液体重悬100ml菌液所得菌体（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱），冰浴10’（细菌处于00C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA，经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。
）
4，4度4000rpm 10’收菌
每100ml菌体用4ml冰预冷的0.1MCaCl2+10%甘油重悬（除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）
5，）
6，4度放置5hr
7，分装100ul/冰预冷的1.5EP，-80度保存
8，取两支分别转质粒和不转验证。