qPCR检测敲减效率 实验方法
qPCR实验操作流程
qPCR实验操作流程Q－PCR实验流程⼀、①实验前准备,每天早上到实验室后，先把超净⼯作台得紫外灯打开１５-2０分钟。
②超净台前做实验,需佩戴⼲净得橡胶⼿套／⼀次性薄膜⼿套,RNA抽提需带⼝罩。
③取ＥP管／枪头时需⽤镊⼦,不可以⽤使⽤过得⼿套直接取⽤。
取完EP管/枪头后，袋⼦及时封好。
④橡胶⼿套须放⼊超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在⼀天⼯作结束后调⾄最⼤量程,并⽤75%⼄醇清洁移液器,枪头盒及超净台⾯。
⑤实验进⾏得过程中或观瞧实验时，没有带⼝罩不要在超净台前讲话。
⼆、总RNA抽提1)细胞培养⽫中细胞样品⽤1*PＢS洗两次后,⽤1ml枪将PBS吸⼲净,加⼊1ml Triｚol（Inviｔｒｏgｅｎ)溶液,吹打混匀,并吸⾄1、5ml RＮase ｆree EＰ管中使细胞充分裂解,室温静置5mｉn；组织样品⽤液氮充分研磨,加⼊1ml Trizｏl (Invitrogｅｎ)溶液,混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2）加⼊200µｌ氯仿,剧烈振荡混匀３０s，使⽔相与有机相充分接触,室温静置３-５min；(离⼼时离⼼管按顺序排放,离⼼完毕,离⼼管得顺序也按顺序排好,与第⼀步得顺序⼀致)３)4℃下,14,000g离⼼1５min，可见分为三层,RNA在上层⽔相，移⾄另⼀个新得RNase fｒｅe EP管;(⽤20-200ul得枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液⾯上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)4）沉淀RNA：加⼊等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次）（不应⽤振荡器混匀),室温静置１0min;5）4℃下,14,000ｇ离⼼10ｍｉn,收集RＮA沉淀(如离⼼后仍不见EＰ管底部有沉淀,应将EP管放置在-８0度冰箱过夜,继续在4℃下,１４,０00g离⼼１0min,收集RNA沉淀),去上清；6）⽤75％⼄醇洗涤两次(12,000g离⼼５ｍｉn)(加⼊⼄醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不⽤振荡器震荡或枪头吸打沉淀）,超净台风⼲;沉淀不能过⼲或过湿，过⼲则不易溶解,过湿则⼄醇残留。
QPCR详细实验过程和仪器操作说明
QPCR实验过程一、细胞培养1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。
1.2 凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。
然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。
1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。
然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。
二、PCR操作过程2.1 M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。
2.2 M-RNA提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。
然后2-8 ℃，12000*g离心15min。
离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。
2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。
此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。
然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml的异丙醇，在冰上放置10min。
qPCR实验操作流程
上，以防止 RNA 复性再次恢复二级结构；
3） 在另一去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega) RNase inhibitor (promega) U6 逆转录引物 5x buffer M-MLV (promega) 总体积
2.0
µl
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0.5
µl
0.5
µl
4.0
µl
0.5
µl
7.5
µl
4） 将 3）溶液加入到 1）溶液中，混匀后 30℃保温 10min；
5） 42℃孵育 50min；
6） 85℃孵育 10min 灭活逆转录酶。
四、定量 PCR 检测 1.引物测试：
根据 mRNA 设计的引物正式实验前需进行 qPCR 测试其特异性和扩增效率， 具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
oligo（dT） Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV
总体积
0.5 µl
0.5 µl
2.0 µl
0.5 µl
4.0 µl
0.5 µl
8.0
µl
4) 将上述 20μl 反应溶液 30℃保温 10min；
5) 42℃保温 50min；
五、逆转录 1. mRNA： 1) 在 RNase free 的 PCR 管中配置下列溶液.
2
Total RNA H2O
总体积
1.0 µg µl
12 µl
2) 将上述溶液吹打均匀，置 85℃保温 5min，使 RNA 变性。随后立即冰上致冷，
以防止 RNA 复性；
qPCR实验操作流程
q P C R实验操作流程 The manuscript was revised on the evening of 2021Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至 RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qPCR实验操作流程49091
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200卩氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min:（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4C下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA :加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4C下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4C下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清：6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qpcr实验步骤及方法
qpcr实验步骤及方法实时定量聚合酶链反应（qPCR）是一种常用于测定DNA或RNA的相对丰度或表达水平的方法。
下面是qPCR实验的步骤及方法。
步骤一：实验前准备1.收集实验所需的试剂和材料，包括DNA或RNA样品、引物、探针、逆转录酶、DNA聚合酶、引物/探针控制、PCR反应缓冲液等。
2.清洁实验平台，并在平台上设置防护措施如UV灯。
步骤二：RNA样品的逆转录1.准备RNA酶切酶，比例为每反应1μgRNA需要加入1μL的RNA酶切酶。
2.加入逆转录酶，比例为每反应1μgRNA需要加入1μL的逆转录酶。
3.需要注意的是，逆转录时可能需要将样品加热至65°C使RNA变性，然后冷却至42°C，以促使逆转录酶逆转录RNA为cDNA。
4.将逆转录反应混合液置于逆转录反应仪中，按照仪器上的指示进行逆转录反应。
步骤三：qPCR反应的设置1.准备qPCR反应液。
根据所使用的qPCR试剂盒的配方，配制相应的qPCR反应液，其中包括PCR缓冲液、dNTPs、酶、引物和探针等。
2.为每个样品和阴性对照设置反应管，每个反应管中加入适量的qPCR反应液和DNA模板。
3.使用qPCR仪器设置反应条件，包括反应温度和时间，以及测定所需的循环数目。
步骤四：进行qPCR反应1.将qPCR反应液加入PCR管中，确保每个反应管中的液体量相等。
2.将PCR管放入PCR仪器中，开始进行qPCR反应。
3.根据仪器上的程序进行PCR反应。
步骤五：分析实验结果1.在qPCR反应结束后，收集结果数据，包括荧光曲线的相对荧光单位（RFU）值和时间。
2.使用反应样本的Ct值和标准曲线，计算相对目标DNA或RNA的数量。
3.根据结果数据分析实验结果并解释实验结果。
需要注意的是，在进行qPCR实验时，要遵守实验室的操作流程和安全规定，并严格控制实验条件，以确保实验结果的准确性和可重复性。
QPCR详细实验过程和仪器操作说明
QPCR详细实验过程和仪器操作说明QPCR（定量聚合酶链反应）是一种用于快速、准确测定DNA或RNA样品中特定序列的浓度的方法。
本文将详细介绍QPCR的实验过程和仪器操作步骤。
实验过程：1.样品准备：将待测DNA或RNA样品提取并纯化。
确保样品的质量和浓度适合QPCR分析。
2.引物设计：设计引物和探针，确保其在目标序列上具有特异性，并且没有多余的副产物。
3.校准曲线：准备一系列已知浓度的标准曲线样品，用于生成标准曲线。
标准曲线通常包含5-6个标准浓度点。
4.反应体系配制：根据实验需要，准备反应体系。
常见的反应体系包括引物、模板DNA或RNA、聚合酶、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和缓冲液。
仪器操作说明：1.准备反应管：在无菌条件下，将QPCR反应混合物分配到每个反应管中。
确保每个反应管中的混合物组成相同，并尽量避免气泡的产生。
2.反应管密封：使用盖板密封每个反应管，确保反应过程中的蒸发和污染最小化。
3.进入PCR机：将每个反应管放入热循环仪（PCR机）中，并按照下列程序设置反应条件：- 热活化（Hot start）：将样品加热至95℃，通常持续2-10分钟，以破坏可能存在的非特异性扩增产物。
-反应循环：将样品依次加热至目标温度（通常为94-98℃）进行DNA的解离，然后降温至引物结合温度进行引物结合和扩增。
通常需要25-40个循环。
-结束延伸：在最后一个循环结束时，将样品加热至72℃进行延伸，以确保所有引物的扩增完成。
-终止反应：在所有反应循环结束后，通常会将样品保持在4℃，防止扩增产物的退化。
4.数据分析：使用专门的软件对QPCR数据进行分析，包括计算阈值周期数（Ct值）、计算目标序列的相对表达量等。
QPCR是一种非常精确和灵敏的方法，但在操作过程中应注意以下几点：-使用无菌操作，以避免样品污染。
-严格控制反应条件和时间，确保反应的重复性和准确性。
-正确安装和使用PCR机以确保温度的准确控制，并避免样品间的交叉污染。
qPCR效率测定实验方案
qPCR效率测定实验方案默克sigma-aldrich®带你走进qPCR效率测定的实验室。
QPCR条件优化QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。
优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。
两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。
优化了测定后，重要的是验证反应效率。
在报告和比较测定方案时，此处信息非常重要。
在本文的实验方案示例中，比较了在广泛和狭窄的cDNA浓度动态范围上的测定效率。
在实践中，通常根据样品的预期目标范围来选择一个单个测试范围，因此可以根据实验要求调整给定的实验方案。
在本文的示例中，使用10倍和2倍连续稀释液计算效率。
标准曲线应包含目标基因的预期表达范围。
注意，使用ReadyScriptt®RT试剂盒时，cDNA产量与RNA输入的比例是线性的，因此如果使用RT-qPCR系统的话，可通过下列操作将本文的实验方案改编成适用于那个系统的：1）稀释RNA，并运行RT反应；2）然后在每个得到的cDNA样品上运行qPCR（相关示例请参见）。
然而，情况并非总是如此，并不适用于所有逆转录试剂盒或实验方案。
在将此实验方案改编用于替代试剂盒之前，应进行验证。
设备•定量PCR仪器•PCR设置的层流罩（选购件）试剂•用作标准曲线模板（例如cDNA、gDNA或合成模板）的DNA•KiCqStart SYBR®Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，参见表 P4-6)。
•PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
•用于测试基因的正向和反向引物（10 μM储备）。
•KiCqStart® SY BR® Green qPCR ReadyMix™（货号KCQS00）KiCqStart® SYBR® GreenqPCRReadyMix™Low Rox(货号KCQS01）KiCqStart® SYBR® GreenqPCRReadyMix™带ROX（货号KCQS02）KiCqStart® SYBR® GreenqPCRReadyMix™用于 iQ（货号KCQS03）兼容仪器：兼容仪器：兼容仪器：兼容仪器：Bio-Rad CFX384™AppliedBiosystems7500AppliedBiosystems5700Bio-RadiCycler iQ™Bio-Rad CFX96™AppliedBiosystems7500AppliedBiosystems7000Bio-Rad iQ™5Bio-Rad MiniOpticon™Fast AppliedBiosystemsViiA 7AppliedBiosystems7300Bio-RadMyiQ™Bio-Rad MyiQ™StratageneMx3000P®AppliedBiosystems7700Bio-Rad/MJ Chromo4™StratageneMx3005P™AppliedBiosystems7900Bio-Rad/MJ Opticon 2 StratageneMx4000™AppliedBiosystems7900 HT FastBio-Rad/MJ Opticon®Applied Biosystems 7900HTCepheid SmartCycler®Applied Biosystems StepOnePlus ™Eppendorf Mastercycler®ep realplex Applied Biosystems StepOne™Eppendorf Mastercycler®ep realplex2 sIllumina EcoqPCRQiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000Qiagen/Corbett Rotor-Gene® QRocheLightCycler® 480表 P17-42.SYBR® Green PCR Mix™选择指南耗材•无菌过滤器移液管吸头•无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)•PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：• 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）• 孔板- 96孔板 (Z374903)- 384孔板 (Z374911)• 孔板密封- ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)- ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)本方案注意事项•使用随机引发或oligo-dT方法生成cDNA（参见标准逆转录实验方案（两步法））。
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qPCR实验操作流程
`Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至 RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）,5）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；6）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；7）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。
该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。
本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。
实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。
2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。
3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。
4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。
根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。
5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。
6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。
根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。
7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。
根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。
3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。
常见的统计方法包括t检验、方差分析等。
总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。
在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。
qPCR检测敲减效率 实验方法
qPCR检测敲减效率实验方法实验流程描述培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。
感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染5天后收集细胞，采用RT-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况，进而判断靶点的干扰效果。
流程图目的细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下表所示：说明：1：Scr-siRNA为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组（Negative Control）；2：gene-siRNA为正常目的细胞，加RNAi靶点病毒感染的细胞组（Knock Down）；实验步骤：1．准备靶细胞1.1细胞复苏1) 从液氮罐中取出细胞冻存管2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱培养6) 次日更换一次培养液后再继续培养1.2 细胞传代1) 将生长90%汇合的细胞进行传代2) 弃去旧培养液，加入2 ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液3) 加入1 ml胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养2．靶细胞慢病毒感染1) 处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液2) 将细胞悬液（细胞数约为2×105）接种于6-well中，37℃5%CO2 培养箱培养待细胞融合度达到10%~20%3) 根据MOI值，加入适宜量的病毒4) 12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基5) 感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于50%者继续培养，待感染时间达到5天后收集细胞抽提RNA进行RT-PCR检测实验；感染效率低于50%的实验组，重新进行感染实验3．Real time PCR3.1 总RNA抽提（根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行）1) 收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml eppendorf管中2) 每管加入200 µl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min3) 4℃，12000 rpm，离心15min4) 吸取上清移至新的1.5 ml eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10 min5) 4℃，12000 rpm离心10 min后，去上清6) 加入至少1 ml 75%乙醇（用DEPC处理过的水新鲜配制），洗涤沉淀7) 4℃，10000 rpm离心5 min，弃去大部分上清8) 4℃，10000 rpm再次离心5 min，吸去上清9) 室温干燥10) 待RNA基本透明时，加入20 µl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度3.2 RNA逆转录获得cDNA（根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行）M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司，Oligo dT购自上海生工，RNase -free 的物品都购自Axygen，具体步骤如下：1) 将1 µl Oligo dT(0.5µg/µl) 和2.0 µg T otal RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于0℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火2) 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心3) 上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使RT酶失活4) 将得到的RT产物--cDNA 置于-80℃保存备用3.3Real-time PCR检测1) 按下列比例配置反应体系：2) 设定程序为两步法Real-Time PCR：预变性95℃，15S；之后每一步变性95℃，5S；退火延伸60℃，30S；共进行45个循环。
qPCR实验操作流程
Q-P C R实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
7） 视沉淀量加入适量DEPC 水（至少15ul ）溶解沉淀。
三、去基因组使用RNase-free 的DNase ?（Promega ），按以下体系配置反应液，37℃消化30min ，65℃灭活10min 。
RNA DNase ?30 20 μl μl ，，； EB染色10min ，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA 的5s rRNA ， 18s rRNA 和28s rRNA 条带，三条条带完整的话即可证明总RNA 抽提比较完整。
五、逆转录 1. mRNA ：1) 在RNase free 的PCR 管中配置下列溶液.2) 将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min ，使RNA 变性。
随后立即冰上致冷， 以防止RNA 复性；3) 在该PCR 管中加入下列试剂（Promega ）oligo （dT ）Random primer0.50.5 μl μl ，再次恢复二级结构；3） 在另一去RNase 的PCR 管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega) RNase inhibitor (promega) U6逆转录引物5x buffer M-MLV (promega)2.0 0.5 0.5 4.0 0.5μl μl μl μl μlTotal RNA H 2O1.0 μg μl总体积12μl总体积7.5 μl4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min；5）42℃孵育50min；6）85℃孵育10min灭活逆转录酶。
qPCR实验操作流程49091
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15—20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用.取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75％乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面.⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1＊PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1。
5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；(管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层,RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；(用20—200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA:加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6—8次）(不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在—80度冰箱过夜，继续在4℃下，14，000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75%乙醇洗涤两次（12，000g离心5min)（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干；沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
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qPCR检测敲减效率
实验方法
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。
感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染5天后收集细胞，采用RT-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况，进而判断靶点的干扰效果。
流程图
目的细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下表所示：
说明：
1：Scr-siRNA为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组（Negative Control）；
2：gene-siRNA为正常目的细胞，加RNAi靶点病毒感染的细胞组（Knock Down）；
实验步骤：
1．准备靶细胞
1.1细胞复苏
1) 从液氮罐中取出细胞冻存管
2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻
3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min
4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台
5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有
3 ml含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱培养
6) 次日更换一次培养液后再继续培养
1.2 细胞传代
1) 将生长90%汇合的细胞进行传代
2) 弃去旧培养液，加入2 ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶
液
3) 加入1 ml胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来
4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来
5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养
2．靶细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液
2) 将细胞悬液（细胞数约为2×105）接种于6-well中，37℃5%CO2 培养箱培养待
细胞融合度达到10%~20%
3) 根据MOI值，加入适宜量的病毒
4) 12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养
基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基
5) 感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于50%者继续培
养，待感染时间达到5天后收集细胞抽提RNA进行RT-PCR检测实验；感染效率低于50%的实验组，重新进行感染实验
3．Real time PCR
3.1 总RNA抽提（根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行）
1) 收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打
后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml eppendorf管中
2) 每管加入200 µl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min
3) 4℃，12000 rpm，离心15min
4) 吸取上清移至新的1.5 ml eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉
淀10 min
5) 4℃，12000 rpm离心10 min后，去上清
6) 加入至少1 ml 75%乙醇（用DEPC处理过的水新鲜配制），洗涤沉淀
7) 4℃，10000 rpm离心5 min，弃去大部分上清
8) 4℃，10000 rpm再次离心5 min，吸去上清
9) 室温干燥
10) 待RNA基本透明时，加入20 µl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽
提RNA的浓度
3.2 RNA逆转录获得cDNA（根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行）
M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司，Oligo dT购自上海生工，RNase -free 的物品都购自Axygen，具体步骤如下：
1) 将1 µl Oligo dT(0.5µg/µl) 和2.0 µg T otal RNA加入到PCR小管中，补充
DEPC-H2O至9ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于0℃冰水混合物中
冰浴，使Oligo dT和模板退火
2) 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心
3) 上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使RT酶失活
4) 将得到的RT产物--cDNA 置于-80℃保存备用
3.3Real-time PCR检测
1) 按下列比例配置反应体系：
2) 设定程序为两步法Real-Time PCR：预变性95℃，15S；之后每一步变性95℃，5S；退火延伸60℃，30S；共进行45个循环。
每次在延伸阶段读取吸光值
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃for 00:15.
Cycle 2: (45X)
Step 1: 95.0 ℃for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃for 00:30.
Data collection and real-time analysis enabled
3) 制作熔解曲线：PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。
从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4S, 同时读取吸光值
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃for 00:04.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃4．统计方法
Real-time PCR数值分析采用2-ΔΔCt分析法。