总RNA的提取和RT-PCR、RTPCR

原核生物启动子

真核生物的转录起始区上游也存在一段富 含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒。 除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性 的序列，如CAAT盒及GC盒等。 真核生物的转录起始较为复杂。

目前已知RNA聚合酶Ⅱ 至少有六种不同的蛋白 因子参与转录复合体的 形成。这些蛋白因子被 称为转录因子 （transcriptional factor, TF）。包括 TFⅡA, TFⅡB, TFⅡD, TFⅡE, TFⅡF, TFⅡI。
按下列组分配制RT反应液
1. dNTP Mix (2.5mM Each) 2. Primer Mix 4 l 2 l
3. 5×RT Buffer
4. DTT (0.1M) 5. HiFi-MMLV (200U/ml)
4 l
2 l 1 l
Total RNA
7 l
反转录反应条件如下 42℃ 40min （反转录反应） 70℃ 15min （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行
小心弃去上清 缓慢沿离心管壁
（7）
轻轻上下颠倒
（8） 洗涤离心管壁
加入1ml 75%乙醇
4℃, 12000g 离心5min 室温干燥沉淀2min 小心尽量弃去乙醇 （9）
加入10μ l DEPC水 溶解沉淀, -80℃保存备用
关键点
所有RNA的提取过程中都有五个关键点：
1.样品细胞或组织的有效破碎； 2.有效地使核蛋白复合体变性； 3.对内源RNA酶的有效抑制； 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
原 理
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和以反转录产物
cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA
为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用 途方便，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA
病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。

RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚 合，所依赖的模板DNA链的方向为3’ →5’，而 RNA链的合成方向为5’ →3’。

合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信 息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信 息，则称为多顺反子。
原核生物中RNA聚合酶全酶由5个亚基构成， 即α2ββ’ δ。 δ亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成 开始后被释放，余下的部分（ α2ββ’ ）被称为 核心酶，与RNA链的聚合有关。
2. 依赖辅助因子的终止：由终止因子（ρ因子）识别特异 的终止信号，并促使RNA的释放。
总RNA的提取、 RT-PCR、 实时定量PCR检测mRNA表达量
实验流程
提 取 总RNA 定 量
RTPCR 合成cDNA 第一链
实时定 量PCR
提取原理 操作步骤
计算方法 操作步骤
原理体系 引物选择
逆转录原理 操作步骤
（二）引物的选择
1. 随机六聚体引物：此种方法适合各种RNA的RT，尤其适合峰度低 的模板和具有复杂二级结构的模板，体系中所有RNA分子全部充 当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。Oligo(dT)要求RNA必 须有Poly A，所以适用于真核生物的mRNA。 Oligo(dT)主要适合 长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有 明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。
原理体系 操作步骤
总RNA的提取
目 的
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研 究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、 定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。
RNA提取流程
1. 样品预处理：最好使用新鲜的样品或取样后立即在低 温冷冻保存的样品，避免反复冻融。不同来源的样品， 处理方式各有差异：
3. 特异性引物：常用于一步法RT-PCR实验中，前提是知道模板的特 异性序列。在一步法RT-PCRs实验中，对于特异性引物的设计质 量以及操作人员的实验技能要求较高。
（三）内参的设定
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因 时，加入一对内参基因的特异性引物，同时扩增内参DNA， 作为对照。 常用的内参有GAPDH （3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin （β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误 差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差 等所造成的误差。
•
DNA指导的RNA聚合酶
• 单链DNA为模板
• 四种核糖核苷酸（NTP）为底物 • 不需要引物 • 从5’端→3 ’端聚合RNA • 无校正功能
转录的不对称性
转录的不对称性就是指以双链DNA 中的一条链作为模板进行转录，从而将遗 传信息由DNA传递给RNA。

对于不同的基因来说，其转录信息可以存 在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那 条DNA链称为负链（模板链），而与之互补的 另一条DNA链称为正链（编码链）。
3. 延伸
δ因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿 DNA链移动，按照碱基互补原则，不断聚合 RNA。
4. 终止
终止子：提供转录终止信号的DNA序列。
RNA转录合成的终止机制有两种： 1. 自动终止：模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的 富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形 的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA 转录的终止。
悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 ×106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或 剧烈振荡以裂解细胞。 培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按 10cm2/ml比例加入。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比
操作步骤
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥， 再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高 压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理 过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
RNA (μg/ml) = 40×OD260 读数×稀释倍数(n)
Leabharlann Baidu
RNA纯度检测
分光光度计法:
RNA纯品的OD260 /OD280 的比值为2.0，故根据OD260
/OD280 的比值可以估计RNA的纯度。
若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染； 若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿 抽提，以乙醇沉淀纯化RNA； 若比值太高（大于2.2），则提示RNA有降解。
仪器和主要试剂
1. 基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应 管
2. 总RNA 3. 第一链cDNA合成试剂盒 （含有逆转录酶、 RNA酶抑制剂、缓冲液） 4. dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2 mmol/L
操作步骤
采用康为世纪HiFi-MMLV cDNA Kit 合成cDNA第一链
RNA转录基本过程
曹玉霖 2018.11.13
DNA指导下的RNA合成
• 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模 板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递 给RNA的过程称为转录。 RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一 段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终 止位点。特定起始点和特定终止点之间的DNA链 构成一个转录单位。
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时 离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 .
用移液枪反复吹吸，直至 收集适量细胞， （1） 裂解液中无明显沉淀 加1ml Trizol 室温静置3min
（2）
向裂解液中 加200 μ l氯仿
盖紧离心管盖，用手振荡15s 室温静置3min （3）
4℃, 12000g 离心15min
（4）
吸取上清液400~450 μ l 向上清中加入等体积 上下颠倒离心管充分混匀 至另一新离心管中 室温静置5min （6） （5） 异丙醇混匀 (切忌吸出白色中间层) 4℃, 12000g 离心10min
（一）反转录酶的选择
1. 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性 相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造 成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。
2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H 活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性 反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的 二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA， 这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较 长cDNA。
RNA评价与鉴定
分光光度计法检测RNA的浓度：RNA在260nm波长处
有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓 度，OD值为1相当于大约 40μg/ml 的单链RNA。用双蒸水稀 释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:

植物材料-液氮研磨
动物材料-匀浆、液氮研磨


细菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠处理
RNA提取流程
2. 细胞裂解
方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机 溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取 法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；
RNA完整性检测
琼脂糖凝胶电泳：
完整RNA的电泳可明显地观察 到28S和18S两条带，并且28S 大约是18S的两倍宽（RNA完整 性较好）。
若两条带不明显, 则说明RNA部 分降解,可能的原因是污染了 RNase。
逆转录-聚合酶链反应
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)
PCR反应体系
取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂 (注意每换一种试剂换一个新吸头)： 第一链cDNA 2l
PerfectShot Taq(绿色) 上游引物 (10M)
下游引物 (10M) RNase free H2O
10l 1l
1l 6l
总体积
20l

真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏 覃碱敏感性分为三种，它们均有10~12个大小 不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也 不同。
RNA转录合成的基本过程
1. 识别
原核生物RNA聚合酶的δ因子识别转录起始点，并促使 核心酶结合形成全酶复合物。 RNA聚合酶与与启动子结合后，可开始转录。 启动子：位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起 始转录有关的一些DNA顺序称为启动子。 原核生物中的两个启动子：-10序列和-35序列。
真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录因子及其功能
2. 起始
a. RNA聚合酶结合在DNA上形成闭 合启动子复合体；


b. δ因子促使聚合酶由闭合启动子 复合体转变为开放启动子复合体；
c. 聚合酶合成9~10nt的初生RNA产 物； d.聚合酶的启动子清除，进入转录 延伸阶段， δ因子在此时或进入延 伸阶段以后被释放。