小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

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物中心提供;DMEM干粉购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶(Tryp-sin)、青霉素一链霉素均为Sigma公司产品;D—Hankg液为实验室自配;MouseAnti-GFAP单克隆抗体及CY5Anti.Mouse荧光二抗购自Chemicon公司;Hoechst为Sigma公司产品。

2.原代培养①取1—3d的新生ICR小鼠,将其断头处死,在无菌条件下由腹侧取出脊髓,置盛有D—Hankg液的小皿中,在解剖显微镜下剔除脊膜,随后换到另一干净的小皿中。②在小皿内剪碎脊髓,大小为1×1×1,再将其移人尖底离心管中,加2~3倍体积的0.25%胰蛋白酶,在37℃下消化15min,加入等体积的含血清培养基(不含抗生素)终止消化;轻吹20次左右,静置片刻,将上清吸人另一离心管中,原离心管中加入1mlD—Hankg轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中,在原离心管中加入l~2ml的0.25%胰蛋白酶再次消化15min,终止后连同上次消化的上清液一起1500rpm离心5min,弃上清液,再加入含10%血清的DMEM培养基,机械吹打使细胞分散,制成单细胞悬液。③血细胞计数板计数后调整密度到l×105接种于无底物黏附的25cm2玻璃培养瓶,在37℃,5%CO:培养箱中培养。④每天倒置显微镜下对细胞进行观察,接种24~48h后细胞第一次换液,以后每周换液两次。

3.星形胶质细胞的纯化细胞培养7~10d待细胞分层生长后,置于37。C摇床中200r/min振荡6h,弃含脱落细胞的细胞悬液,D-Hankg液洗3次,加入含10%血清的DMEM培养基,放入37℃,5%CO:培养箱中继续培养。为提高星形胶质细胞的纯度,可在传代后约5—7d细胞融合时,再次放人摇床中振荡,重复上述操作。

4.传代培养①取已培养15d左右的原代培养物,吸去旧培养基,用D—Hank童液洗2次,然后滴加

4001zl0.125%胰酶一EDTA,倒置显微镜下观察,待细胞回缩,细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消

化,并轻轻左右摇动培养瓶,随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液,分别接种于另两个25cm2的培养瓶,在37℃,5%C02条件下培养。②每天进行倒置显微镜下观察,根据细胞的生长情况及液体颜色改变加补液体或换液。

5.星形胶质细胞的鉴定取第三代培养物接种于

六孔板内,24h后待细胞恢复后取出,吸去培养液,用PB快速洗两次,每孔分别加入少许4%多聚甲醛,室温下固定30min,去除固定液,用0.01mol/LPBS洗三遍,以含10%马血清的0.Olmol/LPBS液在37℃条件下封闭20min。加鼠抗GFAP的一抗(1:500),放入4。C冰箱过夜,次日用0.01mol/LPBS清洗三遍后同时加入CY5标记的抗小鼠二抗(1:100)和Hoechst(1:400),避光放人37。C水浴孵箱lh,再用0.01moL/LPBS洗三遍后晾干,用抗荧光衰减的封片剂封片,O.1ympusFVl000激光共聚焦显微镜下观察。

结果

倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况良好。分离的小鼠脊髓细胞在培养(种植)4h后,部分细胞即可长出细小的胞突;36h后,所有细胞均已贴壁,光晕明显,并长出突起,培养4—5d后,细胞数量增多,约lOd左右细胞达到80—90%会合,可进行摇床纯化。随着培养时间的延长,培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大,而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。

传代后细胞生长更活跃,培养5~7d便可长满瓶壁,星形胶质细胞的比例增多,形态结构更加突出。相差显微镜下形态学特征:胞体较大而扁,形状不规则,胞质较丰富,细胞核圆形或卵圆形,常偏于胞体的一侧,内有1—2个核仁,星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长,呈放射状(图1,2),经GFAP特异性抗体的免疫荧光染色证实98%为星形胶质细胞(图3)。

圈1.2倒置显微镜下传代培养8d的胶质细胞(×100,x200)

图3g玳dg,养星形胶质细胞x10(激光共聚焦显微镜图象bar=40ttm)GFAP免疫荧光染色bHo∞hsl染色c

C,FAP和Hoeehst共定位图象

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小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

作者:黄艳丽, 许蕾, 段伟松, 蒋怡芳, 姜虹, 郭艳苏, 范志亮, 张瑞燕, 任文博, 李春岩, HUANG Yan-li, XU Lei, DUAN Wei-song, JIANG Yi-fang, JIANG Hong, GUO

Yan-su, FAN Zhi-liang, ZHANG Rui-yan, REN Wen-bo, LI Chun-yan

作者单位:050000,石家庄,河北医科大学第二医院神经内科;河北省神经病学重点实验室

刊名:

脑与神经疾病杂志

英文刊名:JOURNAL OF BRAIN AND NERVOUS DISEASES

年,卷(期):2009,17(3)

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