小鼠星形胶质细胞的培养
星型胶质细胞文档
3．厡代星形胶质细胞的培养和纯化(1)取新生1天内的wistar大鼠，全身浸入75%酒精中消毒4-5min;(2)在无菌操作台内采用无菌方法迅速取出大脑，置于一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中（置于冰上低温操作），洗掉大脑表面的血液; (3)然后将大脑放入另一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中，小心用软毛刷刷掉软脑膜;(4)剪取大脑皮层组织，放入另一盛放0.125%胰酶（2ml）的玻璃称量瓶里，用眼科剪将所取组织剪成小块，盖上盖子，放入培养箱内37℃下消化15min;(5)取出消化后的组织，加入2ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰酶消化，用巴士德吸管反复吹打组织至无肉眼可见组织块的浑悬状态，经直径70μm的钢质筛网过滤;(6)然后将细胞悬液在低温(4℃)离心机中离心(1000rpm，5分钟) 后去上清，细胞沉淀加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液;(7)计数后以1×106个/m1的细胞密度接种于0.lmg/ml多聚赖氨酸包被过的塑料培养瓶中;(8)放于饱和湿度培养箱中培养（37℃，5%CO2，95%空气）。
第二天换液，以后每3天换一次液直至汇合;(9)细胞汇合后(约第6天)后在37℃恒温摇床振摇(150rpm)1小时，弃上清以纯化星形胶质细胞;(10)用D-Hank’s液涮洗细胞，后用含0.25%的胰酶的D-Hank’s液消化约5分钟后，加等量含血清培养基终止消化，吹悬细胞，以1:2传代种于新的塑料培养瓶;(11)两次传代后接种于铺有包被过盖玻片（0.lmg/ml多聚赖氨酸包被）的六孔板中(用于免疫组化)，或直径为100mm培养皿(用于流式细胞仪检测或Western blot检测)。
4.星形胶质细胞氧糖剥夺和复氧(OGD-R)培养同一代的原代皮层星形胶质细胞分组进行OGD-R损伤模型的制备。
将实验分为3组：正常培养对照组，OGD-R组，OGD-R+C225干预组，正常培养对照组不作处理维持在正常氧、糖、血清的状态下培养，OGD-R 组细胞用无糖无血清DMEM培养基洗涤2次，然后加入无糖无血清DMEM培养基，放入缺氧培养箱（93%N2，5%CO2，2%O2 ，37℃）中培养2小时；C225干预实验在OGD处理前加入不同浓度的C225（2µg/ml，10µg/ml）预处理1小时，然后同样用无糖无血清DMEM 培养基洗涤2次，加入无糖无血清DMEM培养基并再次加入不同浓度的C225（同前）放入缺氧培养箱中同样缺氧培养2小时；然后将各组细胞取出，换上正常糖、血清的培养基（C225组再次加入C225）放入正常氧培养箱中进行复氧，根据各组复氧不同时间（3h，6h，12h，24h）后收取细胞进行相关检测。
小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立
万方数据１８４物中心提供；ＤＭＥＭ干粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐ－ｓｉｎ）、青霉素一链霉素均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｄ—Ｈａｎｋｇ液为实验室自配；ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＧＦＡＰ单克隆抗体及ＣＹ５Ａｎｔｉ．Ｍｏｕｓｅ荧光二抗购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；Ｈｏｅｃｈｓｔ为Ｓｉｇｍａ公司产品。
２．原代培养①取１—３ｄ的新生ＩＣＲ小鼠，将其断头处死，在无菌条件下由腹侧取出脊髓，置盛有Ｄ—Ｈａｎｋｇ液的小皿中，在解剖显微镜下剔除脊膜，随后换到另一干净的小皿中。
②在小皿内剪碎脊髓，大小为１×１×１，再将其移人尖底离心管中，加２～３倍体积的０．２５％胰蛋白酶，在３７℃下消化１５ｍｉｎ，加入等体积的含血清培养基（不含抗生素）终止消化；轻吹２０次左右，静置片刻，将上清吸人另一离心管中，原离心管中加入１ｍｌＤ—Ｈａｎｋｇ轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中，在原离心管中加入ｌ～２ｍｌ的０．２５％胰蛋白酶再次消化１５ｍｉｎ，终止后连同上次消化的上清液一起１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，再加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，机械吹打使细胞分散，制成单细胞悬液。
③血细胞计数板计数后调整密度到ｌ×１０５接种于无底物黏附的２５ｃｍ２玻璃培养瓶，在３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养。
④每天倒置显微镜下对细胞进行观察，接种２４～４８ｈ后细胞第一次换液，以后每周换液两次。
３．星形胶质细胞的纯化细胞培养７～１０ｄ待细胞分层生长后，置于３７。
Ｃ摇床中２００ｒ／ｍｉｎ振荡６ｈ，弃含脱落细胞的细胞悬液，Ｄ－Ｈａｎｋｇ液洗３次，加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，放入３７℃，５％ＣＯ：培养箱中继续培养。
为提高星形胶质细胞的纯度，可在传代后约５—７ｄ细胞融合时，再次放人摇床中振荡，重复上述操作。
４．传代培养①取已培养１５ｄ左右的原代培养物，吸去旧培养基，用Ｄ—Ｈａｎｋ童液洗２次，然后滴加４００１ｚｌ０．１２５％胰酶一ＥＤＴＡ，倒置显微镜下观察，待细胞回缩，细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消化，并轻轻左右摇动培养瓶，随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液，分别接种于另两个２５ｃｍ２的培养瓶，在３７℃，５％Ｃ０２条件下培养。
小胶质细胞的研究方法
小胶质细胞的研究方法小胶质细胞是一类位于中枢神经系统的非神经元细胞，它们在神经发育、维持神经环境稳定以及参与神经传导等方面发挥着重要的作用。
因此，研究小胶质细胞的方法对于深入了解神经系统的功能和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的小胶质细胞研究方法。
一、细胞培养小胶质细胞的细胞培养是研究小胶质细胞的基础方法之一。
细胞培养可以提供一个受控的实验环境，使得研究者可以对小胶质细胞进行多种实验操作。
通常，从小鼠或人脑中分离小胶质细胞，然后将其培养在含有合适培养基和生长因子的培养皿中。
通过细胞培养，可以研究小胶质细胞的形态、生理功能以及对外界刺激的响应等方面的特性。
二、免疫组织化学免疫组织化学是一种常用的研究小胶质细胞的方法。
通过标记特定的抗体，可以检测和定位小胶质细胞中的蛋白质或其他分子。
例如，通过使用特异性抗体标记小胶质细胞的特定表面标志物，可以帮助研究者确定细胞的类型和分布情况。
此外，免疫组织化学还可以用于检测小胶质细胞在神经系统中的反应和功能改变。
三、转录组学分析转录组学分析是研究小胶质细胞基因表达的重要方法。
通过RNA 测序技术，可以全面地了解小胶质细胞中基因的表达水平和变化。
这种方法可以帮助研究者发现小胶质细胞在不同发育阶段、疾病状态或受到不同刺激时的基因表达差异，进而揭示小胶质细胞在神经系统功能和疾病中的作用。
四、原位杂交原位杂交是研究小胶质细胞基因表达和分布的重要方法之一。
通过标记适当的探针，可以检测和定位小胶质细胞中具体基因的mRNA。
这种方法可以帮助研究者确定小胶质细胞中不同基因的表达模式和分布情况，进一步了解小胶质细胞的功能和相互作用。
五、功能性研究为了研究小胶质细胞的功能和影响，研究者还可以使用多种功能性实验方法。
例如，通过细胞钙成像技术可以监测小胶质细胞中的钙离子浓度变化，从而研究其对于神经信号传导的调控作用。
此外，还可以利用细胞电生理技术记录小胶质细胞的膜电位变化，以及使用基因敲除或过表达等方法研究小胶质细胞中特定基因的功能。
小鼠星形胶质细胞电转条件
小鼠星形胶质细胞电转条件你知道星形胶质细胞吗？嗯，这个名字听起来有点儿像是外星生物，哈哈，别被吓到了。
它是我们大脑里的一种重要细胞。
可能你会问，星形胶质细胞有啥特别的？别急，听我慢慢说。
简单点说，它们像是大脑里的“保姆”一样，照顾着神经元、支持大脑的工作，甚至帮助清理废物。
所以，搞清楚它们的电转条件，不只是个学术问题，简直是研究脑部疾病、开发新药的关键一步！但是，搞定这个电转条件可不是件容易事儿。
像是给小鼠做实验，弄不好，细胞不吃饭、干脆躺平，那可真是得不偿失了。
说到电转，很多人可能觉得这俩字像是高科技的产物，操作起来就跟修飞机似的。
其实不然。
它只是通过电场把一些小分子或者DNA“送进”细胞里，像是给它们注入新活力，帮助它们“重生”。
你想象一下，如果星形胶质细胞能吸收更多的有用物质，那它们能更加给力地支持大脑的工作，对不对？所以，咱们要通过电转给这些细胞充电，让它们更好地发挥作用。
别以为电转过程就像给手机充电那么简单。
电场的强度、持续时间，甚至是脉冲的间隔，都会影响实验结果。
别小看这些参数，弄不好，细胞就会被“电死”——这不是开玩笑，电场太强或者时间太长，细胞根本受不了，直接“崩溃”。
就像你不小心给手机插了不匹配的充电器，它可能会冒烟或者直接挂掉一样。
所以，选择适合的电转条件，真的是非常重要。
讲真，电转的最佳条件没那么一成不变。
每个实验室的设备不同，操作的人也不同，有时候就得一点点试探着调整，才能找到最适合小鼠星形胶质细胞的“密码”。
有些研究者可能发现，电场强度在几百伏的范围内，小鼠的细胞才能接受“电击”而不至于受伤。
你得调到一个适中的强度，既不让它太轻松，也不至于让它完全失去活力。
你可以试着从小范围的电场强度开始，再逐步增加，反正就是多试几次，找到那个“黄金比例”。
电转的持续时间也不能太长。
你想啊，电场就像是一个催化剂，作用一会儿就够了。
要是它持续得太久，细胞会疲劳，甚至可能“晕倒”——这不是开玩笑！要是时间太短，电场对细胞的作用力就不够，DNA都不想被送进去，干脆不接收，真是白忙活。
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。方法分子生物学
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。
方法分子生物学篇11.引言：介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法：详细阐述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程，包括所需的试剂、器材、具体操作步骤等。
3.结果与讨论：展示分离和培养的结果，并对其进行讨论，包括细胞的生长状况、形态、纯度等。
4.结论：总结全文内容，强调研究的意义和价值，并提出未来可能的研究方向。
正文小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养是一项重要的研究工作，有助于深入了解这两种细胞在神经系统中的功能和相互作用。
本文将对分离和培养的具体方法进行介绍。
首先，我们需要准备所需的试剂和器材，包括小鼠大脑皮层组织、培养基、胰蛋白酶、离心管、培养皿等。
接下来，按照以下步骤进行操作：1.取出生长良好的小鼠，迅速断头取出大脑，放入预冷的培养基中。
2.在解剖镜下剥离大脑皮层，剪碎成1mm3左右的组织块。
3.加入适量胰蛋白酶进行消化，吹打均匀后置于37℃恒温摇床中消化15分钟。
4.加入适量培养基终止消化，离心收集细胞沉淀。
5.用培养基重悬细胞沉淀，过滤去除组织残渣，将细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养皿中。
6.置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，观察细胞生长状况。
通过上述操作，我们可以成功分离和培养小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞。
在培养过程中，需要注意观察细胞的生长状况和形态，以及细胞的纯度。
同时，也需要对培养基的成分和更换频率进行合理调控，以保证细胞的正常生长和增殖。
篇21.引言：介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法：详细阐述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程，包括所需的试剂、器材、具体操作步骤等。
3.结果：描述细胞分离和培养的结果，包括细胞的形态、生长情况、纯度等。
4.讨论：对分离和培养过程中可能出现的问题进行分析，并对实验结果的可靠性和有效性进行评估。
bv2小胶质细胞培养方法
bv2小胶质细胞培养方法bv2小胶质细胞是一种常用于神经科学研究中的细胞系，它是从小鼠大脑中的胶质细胞中分离出来并进行培养得到的。
在研究神经炎症、神经退行性疾病等领域，bv2小胶质细胞的培养方法非常重要。
本文将介绍一种常用的bv2小胶质细胞培养方法。
准备培养基和培养器具。
常用的培养基包括DMEM/F12、FBS、青霉素和链霉素等，可以根据实际需要添加其他补充物。
培养器具包括细胞培养板、离心管、移液器等。
接下来，收集小鼠大脑组织并分离胶质细胞。
可以选择小鼠的新生仔或成年小鼠进行实验。
将小鼠的大脑取出，去除外膜和血管，并切成小块。
将切好的组织块转移到含有消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，然后在37摄氏度的恒温培养箱中进行消化。
消化时间一般为30分钟至1小时，根据组织的大小和样本量进行调整。
消化结束后，用培养基停止消化反应，并用离心将细胞沉淀下来。
将沉淀的细胞用培养基重新悬浮，并通过筛网过滤掉组织碎片和大颗粒。
然后，将细胞计数，并根据实验需要进行稀释。
将细胞悬浮液均匀分配到预先涂有培养基的细胞培养板中，使其在培养基中均匀分布。
将细胞培养板放入培养箱中，调节温度为37摄氏度，湿度为95%，并提供适当的CO2气氛（一般为5%）。
每2-3天更换一次培养基，并观察细胞的生长情况。
当细胞达到80%的密度时，可以进行下一步的实验。
在培养过程中，需要注意细胞的健康状态。
细胞应该呈现出典型的胶质细胞形态，即星形或梭形，并有良好的附着性。
如果细胞呈现不正常的形态，或者细胞死亡较多，可能是培养条件不适合，需要进行调整。
培养过程中还需要注意细胞的污染问题。
保持培养器具的清洁和消毒，避免细菌、真菌等污染源的进入。
如果发现培养基出现异常，如呈现黄色或浑浊，可能是细菌污染，需要立即更换培养基。
在bv2小胶质细胞培养过程中，还可以进行相关实验，如细胞增殖实验、分化实验、细胞活力检测等。
这些实验可以进一步研究bv2小胶质细胞的生物学特性和功能。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
星形胶质细胞和少突胶质细胞培养
（二）星形胶质细胞星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。
另一种为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte），它的突起细长，分枝少。
纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。
星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。
调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。
还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。
星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。
（1）方法和结果选择出生2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)后用培养液（90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10ml细胞悬液置。
置36℃、10%CO2 培养箱中培养。
每周换液2 次，培养10-14h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37℃摇床上振荡，16 h （180r/min）O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。
小鼠原代星形胶质、神经元和小胶质细胞培养方法
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星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养Jenny was compiled in January 2021胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。
原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。
以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。
实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。
b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。
c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。
2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。
b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。
c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。
d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。
e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。
3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。
b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。
c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。
d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。
4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。
b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。
c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。
d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。
星形胶质细胞原代培养
新生1-2天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死，取脑放入冷的D-Hanks平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。
分离两侧大脑皮质并剪成1mm 3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min，用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心1000rpm 10min，去上清，再用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀.经75m筛网过滤，收集滤液，离心1000rpm 10min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5106/ml，种植于75cm 2 培养瓶，经1小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75cm2培养瓶继续培养，两天换液一次。
7天后将培养瓶放入水平摇床，260rpms 2小时37℃,换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1小时，重新置于水平摇床，260rpms 18小时37℃，换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA1：1混合液消化、传代备用。
小鼠小胶质细胞原代培养方法！
6、0.4%台盼蓝溶液的配制 台盼蓝 4 g PBS 少许（研磨） PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制： 多聚甲醛 4 g PBS 溶液 100ml 加热至 60，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
（1） 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无 钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2） 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。 （3）用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37作用 20min，期间振摇 2～3 次。 （4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。 （5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要 接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。 （6）置 37、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于 CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。
小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较
小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较【关键词】星形胶质细胞;,离体培养;,反应性星形胶质细胞;bystin［摘要］目的: 比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法，旨在获得高纯度的星形胶质细胞，为进一步研究奠定基础。
方法: :用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。
结果: 原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99%以上，bystin表达量较少，且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮，能耐受长时间模拟缺血，提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。
结论: 经过传代Na3VO4， NaF是磷酸酶抑制剂，如果你作的蛋白是磷酸酶建议不要加。
Aprotinin, leupeptin, pepstatin是蛋白酶抑制剂比较昂贵，如果没条件，只加PMSF也可以，但必须严格操作，防止蛋白降解。
提取的蛋白放－70保存。
纯化的星形胶质细胞纯度最高，可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。
［关键词］星形胶质细胞; 离体培养; 反应性星形胶质细胞;bystinT o establish a cultural method of astrocytes by comparison of different ways of isolation astrocytes from mouse cerebralDU Fang，WU Xiao-mei，ZHU Li（Institute of Nautical Medicine，Nantong University，Nantong Jiangsu 226001，China）［Abstract］Objective: Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to establish an optimal culture method of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods: To acquire purified astrocytes by four usually used cultural methods: primary culture，subculture for three times，shanken overnight once or twice. Results: The purity of primary culture was the lowest，with the method of being subcultured for three times the purest，appear>99% pure. The expression of bys- tin was low and cell ability could be enhanced by short-timed simulated ischemia with the subcultural meth-od. Astrocytes purified by being shanken overnight once or twice highly expressed bystin，immunocytochem-ical staining with anti-mouse GFAP was brighter and could endure simulated ischemia for longer time，which demonstrated that the astrocytes might have been activated by shaking. Conclusion: With the subcultural method we can acquire the purest astrocytes in vitro，which can be induced to reactive astrocytes by simula-ted ischemia，and can best reflect their functions in the brain. It′s an optimal method to acquire the astro-cytes for future study of their functions in vivo and reactive astrocytes.［Key words］astrocyte; in vitro; reactive astrocyte; bystin在中枢神经系统中，胶质细胞是主要的组成部分，其中星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多种作用，组成血脑脊液屏障，营养和支持神经元，与神经元突触的发生有着密切联系［1］。
星形胶质细胞 研究方法
星形胶质细胞研究方法
1. 免疫组织化学：利用特异性抗体标记星形胶质细胞的特定蛋白，通过荧光或显色反应在显微镜下观察其分布和形态。
2. 细胞培养：从脑组织中分离和培养星形胶质细胞，以便在体外进行实验和研究。
3. 基因表达分析：使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光定量 PCR（qPCR）或基因芯片等技术，检测星形胶质细胞中特定基因的表达水平。
4. 蛋白质分析：通过 Western blotting、免疫沉淀、ELISA 等方法，检测星形胶质细胞中特定蛋白质的表达、修饰和相互作用。
5. 细胞功能测定：评估星形胶质细胞的代谢活性、谷氨酸摄取、离子通道功能等。
6. 影像学技术：应用磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）等影像学手段，研究星形胶质细胞在活体中的活动和功能。
7. 电生理技术：使用膜片钳、细胞外记录等电生理方法，研究星形胶质细胞的离子通道和信号传递特性。
8. 动物模型：建立星形胶质细胞相关的动物模型，如转基因或基因敲除小鼠，以研究其在疾病发生和发展中的作用。
9. 单细胞技术：应用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）等技术，分析星形胶质细胞的异质性和不同亚型的特征。
这些方法可以帮助我们深入了解星形胶质细胞的生物学特性、功能以及在神经系统中的作用。
具体的研究方法选择将取决于研究的具体问题和实验条件。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，具有重要的生理功能。
进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。
实验步骤：1.小鼠主星形胶质细胞原代培养（1）准备培养基：将DMEM/F12培养基配制好，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和20ng/mL生长因子（如EGF和bFGF），混匀即可。
将培养基过滤灭菌。
（2）小鼠灭菌和解剖：选取3-5天龄的小鼠，进行表面消毒处理，解剖小鼠颅脑组织。
（3）组织分离：将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中，使用去髓针将组织剪碎，加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。
（4）消化组织：使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化，将组织置于37°C的恒温槽中，用胶性吸管轻轻吹泡，约30分钟后停止消化。
（5）细胞分离：用离心机将细胞分离，将上清液收集到新的离心管中，用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。
（6）细胞计数：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数。
（7）细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中，加入预先配制好的培养基，放入培养箱中，37°C、5%CO2培养。
2.小鼠星形胶质细胞分离纯化（1）胶质细胞去除：在培养2-3周后，使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去，以保留星形胶质细胞。
（2）非星形胶质细胞去除：使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯，将细胞悬浮液转移到离心管中，使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来，再次离心。
（3）细胞计数和分装：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数并分装到新的培养皿中。
（4）鉴定纯化程度：使用免疫细胞化学方法，如免疫荧光染色，检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平，以确定纯化程度。
（5）细胞培养：将纯化后的星形胶质细胞继续培养，并进一步进行功能和机制的研究。
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星形胶质细胞的培养
星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。
用经典的金属浸镀技术（银染色）显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。
细胞突起的末端常膨大形成脚板或称终足，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上，因此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜。
那么星形胶质细胞如何进行培养呢，下面介绍下此细胞的培养方法。
一、实验器械和试剂
器械有剪刀、小镊子、小毛刷等，试剂DMEM/F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿等。
二、星形胶质细胞的混合培养
取新生SD小鼠若干只（出生24h），在无菌条件下断头，迅速剪开颅骨，取出脑组织与预冷的PBS液中反复冲洗以去除血污，再移入另一盛有PBS的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑组织表面的脑膜和血管，用PBS冲洗后剪去脑干仅保留大脑半球，用小剪刀充分剪碎脑组织，加入比组织块总量多30-50倍的0.05%胰蛋白酶，再移入50ml的离心管中，用吸管反复吹打消化至无明显的脑组织块为止，然后加入DMEM/F12完全培养基（含10%的胎牛血清、100U/ml青-链霉素）终止消化，反复吹打制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入一定量的完全培养吹打成单细胞悬液，接种到培养瓶中，置于细胞培养箱中培养，3-4h后更换一次培养液，以后每3天换夜一次，注意观察细胞的生长情况。
三、星形胶质细胞的分离和纯化
将培养于培养瓶中的混合胶质细胞培养液弃去，用PBS清洗2遍，加入0.25%的胰酶于培养箱中消化，在镜下观察至细胞脱落，然后加入完全培养基终止消化，1000r/min离心5min，将细胞沉淀重悬接种于培养瓶中，置于培养箱中培养，稳定1天后，再恒温摇床200r/min振摇2h，吸取上清液（去除一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞），贴壁细胞用0.25%的胰酶消化，方法同上，然后用完全培养基重悬接种到培养瓶中，稳定1天后用于后续实验。