免疫细胞化学常用试剂分解
免疫组织化学实验流程
免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。
以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。
抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。
实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。
二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。
将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。
在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。
三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。
加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。
用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。
四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。
可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。
五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。
将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。
需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。
因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
免疫细胞化学(coverslip)
免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。
）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。
）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。
）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。
）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。
（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。
）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。
）8.用TBST洗2次，5min/次。
（如抗体的非特异多也可多洗。
）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。
10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。
（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组织化学(SP)
免疫组织化学（SP）一、烤片：60℃，1h；二、脱蜡：二甲苯I、II、III各15min；三、水化：100%I、II酒精各10min，95%、90%、80%、70%梯度酒精各5min，再蒸馏水清洗1min；四、修复：将切片浸入0.01M 枸橼酸缓冲液，以微波炉最大火力（98-100℃）加热至沸腾，再将微波炉调至修复档加热约5min（塑料切片架），让后将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；五、灭活：SP试剂盒中的3%过氧化氢，在室温下灭活30min，PBS洗涤3次，每次5min；六、封闭：用山羊血清封闭（即A液），室温封闭30min，倾去多余血清，勿洗涤；七、一抗孵育：分别加入一抗（兔抗IL-6多克隆抗体，1:3000稀释）4℃过夜，第二天取出后室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；八、二抗孵育：滴加SP试剂盒中的二抗（即B液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；九、滴加SP试剂盒中的辣根标记工作液（即C液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；十、DAB显色：配制DAB显色液（DAB浓缩液一滴+底物液1ml），滴加DAB后计时（约1min），保持染色时间一致，在显微镜下观察（即指标变色，背景不变），用蒸馏水终止反应；十一、核复染：苏木素染核5min，自来水漂洗4-5次，1%盐酸酒精分化数秒，自来水中反蓝20min，蒸馏水漂洗3次，每次5min；十二、脱水：梯度酒精70%、80%、90%、95%酒精各5min，100%I、100%II酒精各10min，37℃温箱烤干；十三、透明：二甲苯I、II、III各2min；注意：冰冻切片不需要烤片、脱蜡、水化；直接将切片固定：甲醇，3min，震荡；再清洗：蒸馏水，5min，3次，震荡；即可进行修复及之后的实验步骤。
免疫细胞化学常用试剂
免疫细胞化学常用试剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
免疫组织化学的一般步骤
免疫组织化学是一种用于研究组织中特定抗原或蛋白质表达的方法。
下面是免疫组织化学的一般步骤：
取材和固定：从感兴趣的组织或细胞中取材，常用方法包括活体组织切片或细胞培养。
然后将取得的样本进行固定，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
抗原解露：将固定的样本进行抗原解露处理，以增强目标抗原的可见性。
常用的解露方法包括热解露、酶解露和抗原修复等。
阻断非特异性结合：在进行免疫染色前，需要使用适当的阻断剂或血清来阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果的产生。
抗体染色：将适当的一抗（特异性抗体）加入样本中，与目标抗原结合形成免疫复合物。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
通常会在该步骤中进行洗涤，以去除未结合的抗体。
二抗染色：添加与一抗宿主动物种类不同的二抗（标记有特定染色剂的抗体），使其与一抗结合。
二抗的标记剂可以是酶、荧光染料或金颗粒等，用于可视化免疫反应结果。
可视化：根据标记剂的性质，采用相应的方法对免疫反应结果进行可视化。
例如，使用底物来检测酶标记的二抗，或者直接观察荧光染料的发光信号。
染色和显微观察：在免疫反应完成后，可以对样本进行染色以增强对组织结构的观察。
最后，在显微镜下观察和记录结果。
免疫组化-1
免疫组织化学技术概述免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。
Immunohistochemistry1.概念采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。
实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
2．发展简史☐1941年Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
——建立免疫荧光技术。
☐60年代Nakane铁蛋白标记Ab,用酶代替荧光素来标记抗体的方法——建立酶标抗体技术。
☐70年代Stemberger 改良上述技术——建立辣根过氧化物酶-抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
当今使用最为广泛☐1975年建立单克隆抗体技术。
☐80年代Hsu 等建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
☐90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展☐2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。
凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。
用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。
病理学中的免疫组织化学技术使用教程
病理学中的免疫组织化学技术使用教程免疫组织化学技术是一种常见且广泛应用于病理学研究的分析方法。
它通过将特定的抗体与组织标本中的抗原相互作用，从而提供关于细胞或组织中蛋白质表达和定位的信息。
本文将为您介绍免疫组织化学技术的使用方法和注意事项。
一、实验所需材料和试剂在进行免疫组织化学实验之前，准备好以下材料和试剂是必要的：1. 抗体：选择特异性强、经过验证的一抗，可以有多种来源如商业供应商或自制。
2. 血液清晰剂：例如牛血清白蛋白（BSA）或牛血浆等。
3. 缓冲液：常用的有生理盐水、Tris缓冲液等。
4. 清洗液：例如磷酸盐缓冲液、Tween-20等。
5. 可可粉末或3,3'-二氨基联萘（DAB）显色底物。
6. 高质量的显微镜玻璃片、载玻片和封片剂。
二、步骤以下是进行免疫组织化学实验的通用步骤：1. 组织样本准备：采集病理标本并固定在适当的组织固定剂中，如4%的中性缓冲甲醛。
确保标本大小适宜，以便于透明度好和抗体能够充分作用。
2. 标本处理：将固定的组织样本进行去水和石蜡包埋等处理。
3. 反应抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂（例如胰蛋白酶）进行抗原修复以恢复抗原的活性。
根据不同抗原的性质选择适当的修复方法。
4. 抗体染色：将组织样本与目标抗体进行孵育。
将抗体稀释到推荐浓度中，根据实验要求选择合适的时间和温度进行孵育。
5. 清洗：用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的抗体。
6. 二抗处理：加入适用于一抗的二抗，例如抗IgG。
二抗通常与标记物（如酶或荧光染料）结合，以便于检测。
7. 清洗：再次用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的二抗。
8. 显色：接下来加入可可粉末或DAB等显色底物，观察标本是否出现所需的显色反应。
9. 染色修复：在显色后，如果需要的话，可以执行染色修复以增强显色效果。
10. 去水和挂片：用梯度酒精进行去水，然后将样本挂片，以便于后续显微镜观察。
三、注意事项在进行免疫组织化学实验时，需要注意以下几点：1. 实验室安全：实验时应遵守实验室安全操作规范，戴上手套和口罩，避免接触到可能有害的试剂和组织样本。
免疫细胞化学染色鉴定
免疫细胞化学染色鉴定
免疫细胞化学染色是一种用于鉴定和定量特定细胞类型或蛋白质表达的方法。
它可以帮助科学家和医生确定组织或细胞样本中特定免疫细胞的存在和分布情况，以及这些细胞中特定蛋白质的表达水平。
在免疫细胞化学染色中，通常会使用特定抗体来与目标蛋白质结合，然后通过染色试剂使这种结合可见。
这种方法可以通过显微镜观察细胞或组织样本，并根据染色的强度和位置来确定目标蛋白质的表达情况。
免疫细胞化学染色的过程包括样本制备、抗体处理、染色和显微镜观察。
在样本制备阶段，组织样本通常需要被固定、切片和固定在载玻片上。
接下来，样本会被暴露在特定的抗体溶液中，抗体会与目标蛋白质结合。
随后，样本会经过染色试剂的处理，使得目标蛋白质呈现出可见的颜色或信号。
最后，样本会被放置在显微镜下观察和分析。
免疫细胞化学染色在医学诊断和科学研究中具有广泛的应用。
它可以帮助医生诊断肿瘤、炎症和感染疾病，也可以帮助科学家研
究免疫系统的功能和疾病机制。
通过对免疫细胞化学染色结果的分析，人们可以更好地理解细胞和组织中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病诊断和治疗提供重要信息。
总之，免疫细胞化学染色是一种重要的实验技术，它通过特定抗体的使用和染色试剂的处理，帮助科学家和医生鉴定和定量特定细胞类型或蛋白质表达，为医学诊断和科学研究提供重要的帮助。
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液 0
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。
0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。
一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。
配制方法为：1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）试剂：NaH2PO4•2H2ONa2HPO4•12H2O配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
（1）0.2mol/L的NaH2PO4；称取NaH2PO4.12H2O 31.2g(或NaH2PO4•H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
（2）0.2mol/L的Na2HPO4：称取Na2HPO4.•12H2O哦71.632g（或Na2HPO4•7H2O 53.6g或Na2HPO4•2H2O 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。
（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na2HPO4•12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。
若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）试剂：0.2mol/L PB50mlNaCl 8.5～9g(约0.15mol/L)重蒸水至1000ml配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。
免疫组织化学技术
免疫细胞化学或称免疫组织化学（Immunochistochemistry）是通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。
此方法可以识别定位各种细胞组织成分，发现蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。
在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。
知识点导航一免疫荧光法免疫荧光细胞化学是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中的相应抗原反应，形成抗原与标记抗体的复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素；在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原的技术。
1．免疫荧光染色原理免疫荧光染色是根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与其相对应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，检测出抗原或抗体，并进行定位及定量。
最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescien isothiocyanate，FITC)。
2．染色方法免疫荧光法分为直接法、夹心法、间接法和补体法(1）直接法用荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，检查出相应的抗原成分。
操作方法①冷冻切片、涂片、印片或细胞培养物按要求固定，石蜡切片按常规脱蜡至水。
②用PBS(pH值7.4)充分水洗标本。
③滴加相应的荧光抗体，将标本放入湿盒中，在室温或37℃染色30min，倾去作用液。
④用PBS洗2次，每次5min。
蒸馏水洗1min。
⑤用50％甘油缓冲液封片。
镜检查。
对照染色：可作阴性、阳性、抑制法等对照试验。
2．间接法此法是将荧光素标记到第二抗体上。
先使第一抗体作用于组织切片与抗原反应，用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再与荧光素标记的抗体（第二抗体）作用。
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
1. 供专业人员使用。 2. 该产品中含有叠氮钠 (NaN3)，纯品具有高度的化学毒性。产品中叠氮钠的浓度虽然不能被认定为危险
性浓度，但是叠氮钠可以与铅、铜发生化学反应，形成具有爆炸性危险的叠氮化金属物质。处理时需 要用大量清水冲洗，防止管道中形成金属叠氮化物质。 3. 与所有生物来源的产品相同，必须遵循相关操作步骤。 4. 穿戴合适的个人防护装置，避免皮肤和眼睛接触。 5. 请按照当地、地区以及国家的相关法规，处理未使用的溶液。
【主要组成成份】
1． 提供的试剂 即用型单克隆小鼠抗体以液体形式提供，缓冲液中含有稳定蛋白和0.015 mol/L NaN3。 克隆：AE1/AE3 同型：IgG1，kappa 2．免疫原 人体表皮细胞愈伤组织 (1)。 3．特异性 AE1/AE3 包括两种单克隆抗体，采用人愈伤组织细胞角蛋白免疫小鼠的方法得到 (2)。研究显示， AE1/AE3 能够识别大部分人细胞角蛋白，因此可以作为 IHC 中单层和复层上皮来源的判定工具 (1,2,4)。 抗体 AE1 能够与大部分亚组 A 细胞角蛋白的抗原决定簇发生反应，包括 Moll 分型(4) 中的 10、13、14、 15、16 和 19（分子量分别为 56.5、54'、50、50'、48 和 40 kDa），但是不包括编号为 12、17 和 18（分 子量分别为 55、47 和 45 kDa）的细胞角蛋白(4)。抗体 AE3 能够与亚组 B 细胞角蛋白的抗原决定簇发生 反应，包括编号为 1 和 2、3、4、5、6、7 和 8（分子量分别为 65、67、64、59、58、56、54 和 52 kDa） 的细胞角蛋白(5)。
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
细胞培养常用试剂
器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
免疫细胞化学步骤及说明
1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。
六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。
分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。
关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。
2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。
4℃PBS，洗5min×3次。
吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。
这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。
3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。
固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。
(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。
PBS洗5min×3次。
(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。
PBS洗5min×3次。
细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。
(4)BSA封闭，室温10min。
倾去，勿洗。
(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。
PBS洗5min×3次。
抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。
(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。
PBS洗5min×3次。
(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。
蒸馏水充分冲洗。
(8)苏木素染2min。
自来水充分冲洗。
(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。
封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。
后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。
而且二甲苯太呛人了。
(10)中性树胶封片。
免疫组织化学常用方法大全.pdf
● HRP/POD（辣根过氧化物酶）
显色原理：
HRP + H2O2 体）
HRP ·H2O2 + 供氢体 （电子供
型）
HRP + H2O + 供氢体 （氧化
DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色
● ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT
6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min × 3次 8. 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 9. 观察、记录
second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP
ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10μg/ml biotin 2.5μg/ml 临用前30分钟配制
一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ）
生物素标记的第二抗体与链霉菌 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。
操作步骤： ● 石蜡切片，脱蜡至水； ● 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过
氧化酶的活性； ● 第一抗体； ● 生物素标记的第二抗体； ● 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； ● 显色、复染、封片、观察。
基本原理与操作步骤
第一节 免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。
【2017年整理】常用生化试剂作用
常用生化试剂作用：1、蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，在尿素和SDS中稳定。
一般工作浓度是50—100μg/ml，推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl （pH7.5）,10mM CaCl2。
2、SDS：十二烷基硫酸钠，溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀。
3、IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG和乳糖的结构相似，所以它和乳糖一样，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。
与乳糖不同的是，IPTG不被β-半乳糖苷酶水解。
常与X-GAL一起用于蓝白斑筛选。
作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。
4、X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，是IPTG的显色试剂，在IPTG的催化下显蓝色。
常跟IPTG一起用与蓝白斑筛选。
5、G418：一种抗生素，对几乎所有的细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
6、DMSO：二甲基亚砜。
实验室常用于作液体层析溶剂，同时用作测试物质紫外消光值上时用作参照物。
能溶于所有烷烃和烯烃。
7、曲拉通X-100：TritonX-100，用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用，能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40。
8、NP-40：很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原- 一抗- 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍一、用于鉴别诊断(一)上皮源性：1. 细胞角蛋白/cytokeratin.CK：目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，不同的分子量代表不同类型的上皮标志。
通常将CK 分为两大类型：Ⅰ型（低分子量）；Ⅱ型（高分子量）。
理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮（膀胱）和假复层上皮（呼吸道的被覆上皮）既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。
在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。
目前为止，未发现任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2-10种不同分子量的CK。
因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不可能的。
同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。
因此，CK的免疫组化结果判断是一个较为复杂的问题，在应用这类标记物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。
有必要时，应联合用多种CK加以综合判断。
CK的阳性表达还包括有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。
CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨（肉）瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤（除特殊类型外）。
在判断CK免疫组化结果时应注意几点：（1） CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；（2） CK常出现斑点状的假阳性反应，应注意识别；（3）虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；（4）绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；（5）部分非上皮性肿瘤（平滑肌肉瘤）可见有CK表达，在诊断时应注意；（6）淋巴结、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmin,在判断淋巴结转移癌和肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。
2.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen/EMA）：EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中（也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中），其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。
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免疫细胞化学常用试剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸 150mlKarasson-Schwlt’s PB至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB 至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0．01mol/L PBS 1 000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB 500ml0.01mol/L PBS 500mlTris 约14g浓HCl 少许ECD 10g25%戊二醛 3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS 漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26% NaH2PO4·2H2O 4.15mlB2.52% 8.5mlC、5.4% 葡萄糖5mlD、OsO4 0.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s 液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamb oni’s液等混合固定液。
二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。