第三章基因克隆载体
合集下载
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
第三章 克隆载体的特征及类型
质粒
质粒DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA RNAs ocDNA L-DNA proteins
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z： 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达
ori Apr
pGEM-3E 2743 bp lacZ’
PT7
MCS
PSP6
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II
3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop
（+） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒
质粒DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法
质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
沸水浴法
质粒DNA纯度底、快速、操作简便
碱溶法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
基因工程-3.1载体
非整合型质粒
所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点 的DNA序列， 因此能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复 制周期而实现扩增[图2-3(a)]。
小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的DNA 复制酶来对自身进行拷贝，而一些较大的 质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所 需的专一性酶的基因。
整合型质粒或游离型质粒(episome)
前噬菌体被从宿主细胞切除后，大量新λ 噬菌体DNA 分子通过滚环复制模式被复制出来。形成一个包含 一系列线形基因组的连环体，由COS位点连接在一起。 该内切核酸酶是λ DNA中基因A的表达产物，能够切开 双链DNA分子并形成单链的黏末端，并与其他一些蛋 白相耦联，在将每个λ 基因组包裹入一个噬菌体头 部的过程中发挥作用。
1. 基因组小于10kb：
对一个载体来说恰好处于令人满意的范围。 2. M13基因组的复制型： 非常像质粒，实验时也能够像质粒一样被处理。 3. M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够 通过转染而重新引入。
4. 最重要的是，以M13为载体克隆基因，能够得 到单链形式的DNA。 单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作 用，尤其是DNA测序和体外突变。
分类：基于质粒的主要特征 本质是质粒的基因
质粒分为以下5种：
(1)致育(fertility)质粒或称F质粒 仅携带转移基因，能促进质粒间有性接合转移； 不再具备其他的特征。 如：大肠杆菌中的F质粒
(2)耐药性(resistance)质粒或称“R”质粒 携带有能够赋予宿主细菌对一种或多种抗菌药的耐 药性的基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素或水银。 R质粒通过正常的繁殖而传播, 对细菌感染的治疗产 生深远的影响，如RP4，通常在假单胞菌中被发现， 但也能够在其他细菌中出现
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
第三章 基因克隆载体
第三章 基因克隆载体
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
基因克隆载体
克隆载体的DNA分子必须具备的条 件
作为载体应该具备以下基本条件： 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点，较高的遗传稳定性; 3.具有较小的分子量，易于操作，具有较高的外源 DNA的载装能力 4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点； 5.外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自 我复制;
低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有1-3份拷 贝
松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid
高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-60 份拷贝
质粒复制控制的分子模型
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制 机理的分子模型有两种：
其一是抑制蛋白质稀释模型(inhibitor dilutionmodel)。
(2)自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外 一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋 白质模型,这个模型对质粒DNA复制控制机 理的一种解释是，质粒DNA的复制是由一 种叫做起始蛋白质Rep引发的。这种蛋白 质是质粒DNA复制启动作用的限速因子， 它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒 分子的最终复制总数。
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合 型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带 有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一 套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。
从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗 透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低， 以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类 的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞 的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼 接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机 率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级.
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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pUC19
Multiple Cloning Sites pUC18
pUC系列质粒载体的优点
具有更小的分子量和更高的拷贝数
• pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp • pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因
的缺失
适用于组织化学方法检测重组体
• LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基 因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种 互补现象叫做α—互补。
质粒DNA分子大小1-100Kb以上。
质粒DNA的复制
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；
既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型：
• 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid
去除两 个PstI
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR318 酶切
（6.3Kb)
体外重组 pBR322
pBR320 酶切
(4.3Kb)
(2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁 殖的质粒载体。
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有DNA插入 外源DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
Ampr Tcs
提取DNA 电泳
重组DNA
利
BamHI片段(Tcr)
在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译
在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
特点
• 基因的启动子序列和终止子序列 • 一般无检测标记基因 • 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） • 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。
b
糖苷
X-
CHg2OaH l
HO
O
H OH H
O
H
H
H OH
Cl Br
N
lacZ’
a b-半乳糖苷酶的a-肽段
Cl O Br
N
N
Br Cl
Apr
利 用 菌 落
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Apr
转化
外源DNA 有DNA插入
Apr
颜
色
Ap r
Apr
筛选重组子
筛
白色菌落
选
重
组
提取DNA 电泳
1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质 粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗 性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的 质粒pMB3(13.3Kb)。
pMB3EcoRI* 大肠杆菌
AATT黏性末端环化 pMB8(2.6Kb)
导入
2、从质粒pSC101获得四环 素抗性基因（Tetr)。
建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
pBR322的构建是质粒载体构 建的一个典范。
pBR322的亲本质粒
• pSF2124，含有Amp抗性基因 • pMB1，含有松弛型ColE1的复制
起点（ori） • Psc101，含有Tet抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
结构
• 转化单元--宿主细胞转化 • 表达单元--外源基因表达
表达型载体（expression vector）
类型
• Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 • Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合
序列和起始密码子）+ 终止子 • Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 +
控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pco
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆 载体。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则
• 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 • 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 • 组装合适的选择标记基因。 • 选用合适的启动子。 • 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构
具有多克隆位点MCS区
• pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点 • 具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，
无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/1 9
Plac MCS
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳
子
重组DNA
Apr
2、表达质粒载体
是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质 的质粒载体
• 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载 体（胞内表达载体）和分泌型表达载体
• 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核 细胞表达载体
表达载体与克隆载体的区别
强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体DNA分子合适的位置有一至 多个克隆位点，供外源DNA片段组入克 隆载体DNA分子。
Origin of Replication Hind II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。•
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
在宿主细胞内具有较高的拷贝数。
• 一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件 下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。
CAP protein binding site -
591-554 (compl. strand); mRNA (LacZ) starts at nt position 507 (compl. strand); lac repressor binding site 507-487 (compl. strand).
以大肠杆菌的质粒为例：
• ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的DNA分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的 形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环DNA分子（oc-DNA）或线形 DNA分子（l-DNA）。
在变性条件下，质粒可成为单链DNA 分子（ss-DNA）。
载体的功能及特征
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
终止子（常称之为表达分泌型载体）
ATG
I
II III
转录起始 翻译起始 信号肽
IV
成熟蛋白质
TAA
V
转录终止区
I II III
CS
I
V
CS
I
II
V
ATG CS
I
II III
V
CS--cloning site
• 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
• pBR322质粒 • pUC系列的质粒载体