酪氨酸酶抑制剂筛选
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Km值变小，Vmax值变小，但 Vmax/Km值不变
以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Kis
特殊抑制类型
混合型 抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
混合型的抑制：曲线相交与一点但该点不在X或Y轴上， 一般在第二或三象限
特殊抑制类型
混合型的Ki Kis值与非竞争性计算方式一样 切记：两个数值不一样
上图即为可逆型抑制
不可逆性抑制作用
Km值不变， Vm值与抑制剂量成反比，增大抑制剂量可使反 应速度变为0
抑制类型的判断
• 可逆型抑制类型分为 • 1.竞争性抑制 • 2.非竞争性抑制 • 3.反竞争性抑制
三种类型图示
使1/ v（酶速度）对1/S（酶浓度）作图，可 以获得一条直线。
抑制常数： 1.Km为米氏常数 2.Ki为与酶结合的抑制常数 3.Kis为与酶底物复合物的抑制常数
酶信息
Enzyme-Ligand Interactions
Substrate/Product Inhibitors KM Value Ki Value IC50 Value pH Optimum
酪氨酸酶概述
• 酪氨酸酶（TYR）含铜酶是黑素代谢和儿茶酚胺的 关键酶。酪氨酸酶活性高，黑色素生成增多。因 此，抑制酪氨酸酶活性是有效减少黑色素生成的 一种途径
酪氨酸酶抑制性实验
酪氨酸酶
底物
酪氨酸酶
底物
抑制剂
产物（++++++）多 产物 （++）少或无
酪氨酸酶来源
多酚氧化酶
单酚单氧化酶（酪氨 酸酶） EC.1.14.18.1 双酚氧化酶（儿茶多 酚氧化酶） EC.1.10.3.2 漆酶 EC.1.10.3.1
EC是各种酶的编号 可在The Comprehensive Enzyme Information System（BRENDA）数据库 中找到对应的酶信息
非竞争性
1. 非竞争性抑制作用：抑制剂不能与游离酶 结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生 成，使酶的催化活性降低 2. 特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同 部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对 酶产生抑制作用；c.动力学参数
非竞争性
抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
非竞争： 两线K相交于（-1/Km，0）
酶活测量步骤
1.抑制剂对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
缓冲液（不含抑制剂）
含底物缓冲液+
+பைடு நூலகம்酶液
不同浓度的抑制剂
30度水浴10min
记录每分钟
的OD值
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
以OD值—时间作图
曲线的切线反向延长与X轴相交点 即为—延滞时间 若均相交于一点—抑制剂对延滞 时间没有影响 若不交于一点—抑制剂对延滞时 间有影响 曲线1为无抑制剂的对照组 曲线2—7抑制剂浓度由低到高 切线斜率即为酶活
v= dC /dt
: 3600 M-1cm-1 d: 1cm
确定酶反 应时间！
Time
返回
Kt=有抑制剂的曲线的斜率 K=没有抑制剂的曲线的斜率
酶活的推导
1.Beer定律A=kbc，公式A=kbc kbc εc 我们测得的动力学曲线斜率△A/t= ε△c/t= ε△M/tV
△M/t=△A V /tε
△M/t = kv/ε
△M/t：每分钟多巴色素的生成（mol/min），等同 于每分钟的分解量
延滞时间的原理（多巴为例）
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
抑制剂浓度—延滞时间 作图
抑制剂浓度—Vss 作图
IC50
Vss为酶的活力百分比=Vt/V ×100 ％ IC50即为酶失去一半活力时的抑制剂
结论
• 上述三个图标我们可以得出几点结论 • 1.抑制剂浓度对酶的延滞时间是否有影响？ • 2.计算出酶的活力（酶的剩余活力） • 3.计算酶的抑制酶活 • 4.酶的IC50
曲线1-5抑制剂浓度逐渐上 升（曲线1为对照品） 曲线相交一点且在X轴上 Km值不变，Vm值随浓度 上升而变小
非竞争性图
1.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的斜率作图，该图的斜率即 为Ki 2.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截距作图，该图的斜率即 为Kis 3.非竞争抑制中Ki，Kis的值是一致的
3.反竞争性
酶在不同浓度抑制剂下的作用
该次的测量主要断定此抑制是否可逆？
酶浓度
抑制剂浓度
OD值
A
E 对照
AE AF AG AH
B
F
BE BF BG BH
C
G
CE CF CG CH
D
H
DE DF DG DH
酶在不同浓度抑制剂下的作用
• 以酶浓度—OD值作图 转换
酶浓度—酶活力（剩余活力）
可逆性抑制作用
1.曲线1-5代表不同浓度（有低到高） 的抑制剂，曲线1不加抑制剂的对照组 Y轴是酶活活力,是剩余酶活。所以酶活 达不到100 2.该图是可逆型的，酶活随抑制剂浓度 上升而下降 3.Vm值不变 Km值随浓度上升而上升
• 研究酪氨酸酶抑制剂主要运用于美容行业，防止 植物水果的褐变症。
• 酪氨酸酶结构中心的两个Cu+是活性中心
抑制剂种类
1.含酚基的化合物 与酪氨酸酶的双铜离子活性中心结合, 大多数是酪氨酸酶的竞争性抑 制剂. 2.芪类及其类似物 只有一个羟基取代基时, 该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性; 当结构 中有两个羟基时, 对酪氨酸酶的抑制活性显著增强 3.黄酮类物质 螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力. 4. 醛类化合物 羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团， 形成稳定的螯合配体结构 (席夫碱结构), 生成的产物在酪氨酸酶的疏水性环境中能稳定存在, 并在活 性中心周围形成空间位阻, 阻止底物与活性中心作用, 从而抑制酪氨酸酶 的催化活性, 抑制黑色素的合成.
Km值测定: 米氏双倒数作图法
1.竞争性抑制
• 抑制剂和底物在结构上有某些相似之处， 二者可能竞争与酶分子的同一部位结合。
竞争性抑制
一.特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位， 当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物就不 能再与酶结合，同样反之。 二.竞争性抑制的机理 1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基 团）上，从而阻断了底物和酶的结合 3 降低酶和底物的亲和力。
实验原理
酪氨酸酶催化的反应为：
475nm
酶活的定义
1.酪氨酸酶的酶活定义: 以每分钟催化生成1umol多 巴色素的酶量为一个活力单位。 通过测定酶催化反 应到体酶活系O=1D0467k5随v/ε时(k间斜的率增v体长积曲l线ε消, 从光曲系线数斜) 率即可得 酶比活=106 kv/εm(k斜率,v体积L,ε消光系数,m酶质量 mg ) 2.剩余酶活％=Kt/K ×100 ％ 3.抑制酶活％ （被抑制的活力）=（K-Kt)/K ×100 ％
竞争性图
抑制剂只与酶结合 Ki
竞争： 两线K相交于（0 ，1/Vm）
曲线相交一点且在Y轴上 Vm值不变，Km值随浓度 上升而变大 以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Ki
2.非竞争性
• 非竞争性抑制剂和底物可能分别与酶的不 同部位结合。抑制剂与酶的结合并不妨碍 酶再与底物结合，但所形成的酶—底物—抑 制剂复合
• 对酶活性的一种抑制作用，其特征是反应 的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速 度低，当以速度的倒数相对底物浓度的倒 数作图，所得图线与未被抑制反应的图线 平行
• 抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游 离酶结合的一种酶促反应抑制作用。
反竞争性图
抑制剂只与酶底物复合物结合 Kis 反竞争： 两线K相差0.01 截距相差0.1
总结性图表
抑制剂对单酚酶，多酚酶作用图示
谢谢
米氏方程
½ Vmax
混合级反应 一级反应
v Vmax [S] Km [S]
零级反应
Km
一级反应中可求反应初速度
一、酶活力测定— 酶反应初速度的测定: 常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。
Product Concentration
A =εC d
以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Kis
特殊抑制类型
混合型 抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
混合型的抑制：曲线相交与一点但该点不在X或Y轴上， 一般在第二或三象限
特殊抑制类型
混合型的Ki Kis值与非竞争性计算方式一样 切记：两个数值不一样
上图即为可逆型抑制
不可逆性抑制作用
Km值不变， Vm值与抑制剂量成反比，增大抑制剂量可使反 应速度变为0
抑制类型的判断
• 可逆型抑制类型分为 • 1.竞争性抑制 • 2.非竞争性抑制 • 3.反竞争性抑制
三种类型图示
使1/ v（酶速度）对1/S（酶浓度）作图，可 以获得一条直线。
抑制常数： 1.Km为米氏常数 2.Ki为与酶结合的抑制常数 3.Kis为与酶底物复合物的抑制常数
酶信息
Enzyme-Ligand Interactions
Substrate/Product Inhibitors KM Value Ki Value IC50 Value pH Optimum
酪氨酸酶概述
• 酪氨酸酶（TYR）含铜酶是黑素代谢和儿茶酚胺的 关键酶。酪氨酸酶活性高，黑色素生成增多。因 此，抑制酪氨酸酶活性是有效减少黑色素生成的 一种途径
酪氨酸酶抑制性实验
酪氨酸酶
底物
酪氨酸酶
底物
抑制剂
产物（++++++）多 产物 （++）少或无
酪氨酸酶来源
多酚氧化酶
单酚单氧化酶（酪氨 酸酶） EC.1.14.18.1 双酚氧化酶（儿茶多 酚氧化酶） EC.1.10.3.2 漆酶 EC.1.10.3.1
EC是各种酶的编号 可在The Comprehensive Enzyme Information System（BRENDA）数据库 中找到对应的酶信息
非竞争性
1. 非竞争性抑制作用：抑制剂不能与游离酶 结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生 成，使酶的催化活性降低 2. 特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同 部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对 酶产生抑制作用；c.动力学参数
非竞争性
抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
非竞争： 两线K相交于（-1/Km，0）
酶活测量步骤
1.抑制剂对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
缓冲液（不含抑制剂）
含底物缓冲液+
+பைடு நூலகம்酶液
不同浓度的抑制剂
30度水浴10min
记录每分钟
的OD值
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
以OD值—时间作图
曲线的切线反向延长与X轴相交点 即为—延滞时间 若均相交于一点—抑制剂对延滞 时间没有影响 若不交于一点—抑制剂对延滞时 间有影响 曲线1为无抑制剂的对照组 曲线2—7抑制剂浓度由低到高 切线斜率即为酶活
v= dC /dt
: 3600 M-1cm-1 d: 1cm
确定酶反 应时间！
Time
返回
Kt=有抑制剂的曲线的斜率 K=没有抑制剂的曲线的斜率
酶活的推导
1.Beer定律A=kbc，公式A=kbc kbc εc 我们测得的动力学曲线斜率△A/t= ε△c/t= ε△M/tV
△M/t=△A V /tε
△M/t = kv/ε
△M/t：每分钟多巴色素的生成（mol/min），等同 于每分钟的分解量
延滞时间的原理（多巴为例）
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
抑制剂浓度—延滞时间 作图
抑制剂浓度—Vss 作图
IC50
Vss为酶的活力百分比=Vt/V ×100 ％ IC50即为酶失去一半活力时的抑制剂
结论
• 上述三个图标我们可以得出几点结论 • 1.抑制剂浓度对酶的延滞时间是否有影响？ • 2.计算出酶的活力（酶的剩余活力） • 3.计算酶的抑制酶活 • 4.酶的IC50
曲线1-5抑制剂浓度逐渐上 升（曲线1为对照品） 曲线相交一点且在X轴上 Km值不变，Vm值随浓度 上升而变小
非竞争性图
1.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的斜率作图，该图的斜率即 为Ki 2.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截距作图，该图的斜率即 为Kis 3.非竞争抑制中Ki，Kis的值是一致的
3.反竞争性
酶在不同浓度抑制剂下的作用
该次的测量主要断定此抑制是否可逆？
酶浓度
抑制剂浓度
OD值
A
E 对照
AE AF AG AH
B
F
BE BF BG BH
C
G
CE CF CG CH
D
H
DE DF DG DH
酶在不同浓度抑制剂下的作用
• 以酶浓度—OD值作图 转换
酶浓度—酶活力（剩余活力）
可逆性抑制作用
1.曲线1-5代表不同浓度（有低到高） 的抑制剂，曲线1不加抑制剂的对照组 Y轴是酶活活力,是剩余酶活。所以酶活 达不到100 2.该图是可逆型的，酶活随抑制剂浓度 上升而下降 3.Vm值不变 Km值随浓度上升而上升
• 研究酪氨酸酶抑制剂主要运用于美容行业，防止 植物水果的褐变症。
• 酪氨酸酶结构中心的两个Cu+是活性中心
抑制剂种类
1.含酚基的化合物 与酪氨酸酶的双铜离子活性中心结合, 大多数是酪氨酸酶的竞争性抑 制剂. 2.芪类及其类似物 只有一个羟基取代基时, 该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性; 当结构 中有两个羟基时, 对酪氨酸酶的抑制活性显著增强 3.黄酮类物质 螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力. 4. 醛类化合物 羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团， 形成稳定的螯合配体结构 (席夫碱结构), 生成的产物在酪氨酸酶的疏水性环境中能稳定存在, 并在活 性中心周围形成空间位阻, 阻止底物与活性中心作用, 从而抑制酪氨酸酶 的催化活性, 抑制黑色素的合成.
Km值测定: 米氏双倒数作图法
1.竞争性抑制
• 抑制剂和底物在结构上有某些相似之处， 二者可能竞争与酶分子的同一部位结合。
竞争性抑制
一.特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位， 当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物就不 能再与酶结合，同样反之。 二.竞争性抑制的机理 1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基 团）上，从而阻断了底物和酶的结合 3 降低酶和底物的亲和力。
实验原理
酪氨酸酶催化的反应为：
475nm
酶活的定义
1.酪氨酸酶的酶活定义: 以每分钟催化生成1umol多 巴色素的酶量为一个活力单位。 通过测定酶催化反 应到体酶活系O=1D0467k5随v/ε时(k间斜的率增v体长积曲l线ε消, 从光曲系线数斜) 率即可得 酶比活=106 kv/εm(k斜率,v体积L,ε消光系数,m酶质量 mg ) 2.剩余酶活％=Kt/K ×100 ％ 3.抑制酶活％ （被抑制的活力）=（K-Kt)/K ×100 ％
竞争性图
抑制剂只与酶结合 Ki
竞争： 两线K相交于（0 ，1/Vm）
曲线相交一点且在Y轴上 Vm值不变，Km值随浓度 上升而变大 以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Ki
2.非竞争性
• 非竞争性抑制剂和底物可能分别与酶的不 同部位结合。抑制剂与酶的结合并不妨碍 酶再与底物结合，但所形成的酶—底物—抑 制剂复合
• 对酶活性的一种抑制作用，其特征是反应 的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速 度低，当以速度的倒数相对底物浓度的倒 数作图，所得图线与未被抑制反应的图线 平行
• 抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游 离酶结合的一种酶促反应抑制作用。
反竞争性图
抑制剂只与酶底物复合物结合 Kis 反竞争： 两线K相差0.01 截距相差0.1
总结性图表
抑制剂对单酚酶，多酚酶作用图示
谢谢
米氏方程
½ Vmax
混合级反应 一级反应
v Vmax [S] Km [S]
零级反应
Km
一级反应中可求反应初速度
一、酶活力测定— 酶反应初速度的测定: 常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。
Product Concentration
A =εC d