医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
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III. 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：调节 机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度 损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种如CD25+ CD4+ T细胞。
IV. 记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作 用。
特异性抗原物质：异种抗原，同种组织抗原。
不同的刺激物质可刺激不同的淋巴细胞分化增殖，可以反 应不同细胞群的免疫功能。
刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)
ConA属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面 TCR复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子 簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性 多克隆活化剂。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规 模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及 药敏试验等。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
正置显微镜、倒置显微镜、离心机、酶标仪
实验流程
取脾脏
4h后 检测
制备单细 胞悬液
细胞培 养3天
加入 CCK8
பைடு நூலகம் 实验步骤
I. 取小鼠脾脏、制备单个核细胞悬液、计算细胞 浓度。
II. Con A刺激细胞：将细胞浓度调节为 4x106 /mL，加入96孔板，每孔90μL，加入2.5 μ g/mL 的 ConA 溶 液 10 μL ， 细 胞 培 养 箱 （ 37℃ ， 5%CO2) 中 孵 育 72h 。 培 养 期 间 可 观 察细胞增殖情况。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
T细胞根据功能/表面标志分类
I. 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这 些细胞可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞 毒T细胞的主要表面标志是CD8。
II. 辅助T细胞（helper T cell）：它可以增生扩散来激活其它 类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。主要表面标志是CD4 。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已 知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。
优点：敏感性高，重复性好 缺点：需要特定设备，存在放射性污染
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由日本同仁化学 研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试 剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8 试剂盒利用了日本同 仁化学研究所（Dojindo）开发的四唑盐——WST-8 (2(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)2H-四唑单钠盐)，它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中 的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（ Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。 OD450可间接反映活细胞数量。
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成 分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细 胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8 法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如 MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定 ，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。
T细胞在体外培养时，受到非特异性丝裂原 （如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后， 可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、 细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞。
淋巴细胞增殖活力的高低可以反映机体的细 胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能 的指标之一。
刺激淋巴细胞增殖的物质
非特异性刺激物：植物血凝素（PHA ，刺激T 细胞）、刀豆蛋白A（ConA，刺激T细胞）、 PWM（刺激B、T细胞）、LPS（刺激B细胞） 、抗CD3抗体等。
T淋巴细胞（T-lymphocyte）
T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中 数量最多，功能最复杂的一类细胞。它是淋巴细胞的主 要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅 助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂 原的应答反应以及产生细胞因子等，用以抵御疾病感染 、肿瘤。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫 的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶 细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最 终使免疫效应扩大和增强。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
III.CCK8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
IV. 记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作 用。
特异性抗原物质：异种抗原，同种组织抗原。
不同的刺激物质可刺激不同的淋巴细胞分化增殖，可以反 应不同细胞群的免疫功能。
刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)
ConA属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面 TCR复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子 簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性 多克隆活化剂。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规 模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及 药敏试验等。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
正置显微镜、倒置显微镜、离心机、酶标仪
实验流程
取脾脏
4h后 检测
制备单细 胞悬液
细胞培 养3天
加入 CCK8
பைடு நூலகம் 实验步骤
I. 取小鼠脾脏、制备单个核细胞悬液、计算细胞 浓度。
II. Con A刺激细胞：将细胞浓度调节为 4x106 /mL，加入96孔板，每孔90μL，加入2.5 μ g/mL 的 ConA 溶 液 10 μL ， 细 胞 培 养 箱 （ 37℃ ， 5%CO2) 中 孵 育 72h 。 培 养 期 间 可 观 察细胞增殖情况。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
T细胞根据功能/表面标志分类
I. 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这 些细胞可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞 毒T细胞的主要表面标志是CD8。
II. 辅助T细胞（helper T cell）：它可以增生扩散来激活其它 类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。主要表面标志是CD4 。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已 知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。
优点：敏感性高，重复性好 缺点：需要特定设备，存在放射性污染
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由日本同仁化学 研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试 剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8 试剂盒利用了日本同 仁化学研究所（Dojindo）开发的四唑盐——WST-8 (2(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)2H-四唑单钠盐)，它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中 的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（ Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。 OD450可间接反映活细胞数量。
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成 分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细 胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8 法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如 MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定 ，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。
T细胞在体外培养时，受到非特异性丝裂原 （如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后， 可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、 细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞。
淋巴细胞增殖活力的高低可以反映机体的细 胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能 的指标之一。
刺激淋巴细胞增殖的物质
非特异性刺激物：植物血凝素（PHA ，刺激T 细胞）、刀豆蛋白A（ConA，刺激T细胞）、 PWM（刺激B、T细胞）、LPS（刺激B细胞） 、抗CD3抗体等。
T淋巴细胞（T-lymphocyte）
T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中 数量最多，功能最复杂的一类细胞。它是淋巴细胞的主 要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅 助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂 原的应答反应以及产生细胞因子等，用以抵御疾病感染 、肿瘤。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫 的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶 细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最 终使免疫效应扩大和增强。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
III.CCK8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。