绝对定量简易操作流程

applied biosystems StepOne/StepOnePlus

荧光定量PCR仪

绝对定量实验简易操作流程

绝对定量实验简易操作流程

SDS 2.2

StepOne/StepOnePlus定量PCR仪

绝对定量实验简易操作流程

绝对定量实验简易操作流程

1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne

Software> StepOne Software V2.2开启软件。进入主界面后选择Advanced Setup 。

2.进入Setup下的Experiment Properties界面：

2.1输入实验名称（Experiment Name）

2.2选择仪器型号

2.3

2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve

2.4选择试剂种类

2.5选择运行模式

3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：

3.1在左边界面中设置基因及样本。利用 按钮添加新

的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。

也可以利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。利用 按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。

3.2在右边 界面中进行样品板的排布。利用鼠标单选或拖曳以选择

反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。

3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三

个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷

贝数。按照相同的操作，完成标准曲线其他数据点的设置。（建议设置5个梯度）

4. 在Setup 下的Run Method 界面中，设定反应条件。

5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM

Block 温度梯度功能，需要先在

界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。此时Block 即被

分成六个区块。（此功能仅限StepOnePlus 机型)

然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，

在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。

6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然

后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。

7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：

7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。如果

想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。

7.2查看标准曲线时，可通过更改Plot Settings来改变标准曲线的显示方式。Eff%代表扩

增效率。R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，建议在0.99以上。

7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。

7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。黄色三

角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。

8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。若想存

储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。