绝对定量简易操作流程
绝对定量pcr标准品
绝对定量pcr标准品绝对定量PCR标准品。
绝对定量PCR（Absolute Quantitative PCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的精确数量的技术。
在绝对定量PCR实验中，标准曲线是非常重要的，它可以帮助我们将PCR测得的Ct值转化为目标DNA或RNA的绝对数量。
而标准曲线的制备离不开绝对定量PCR标准品的使用。
一、绝对定量PCR标准品的选择。
在选择绝对定量PCR标准品时，我们需要考虑标准品的稳定性、纯度和准确性。
一般来说，我们可以选择由合成DNA或RNA片段构建的标准品，也可以选择经过精确浓度测定的基因片段。
无论选择哪种标准品，都需要确保其稳定性和准确性，以保证实验结果的可靠性。
二、绝对定量PCR标准品的制备。
制备绝对定量PCR标准品需要进行一系列的稀释操作，以得到一系列已知浓度的标准品溶液。
在制备过程中，需要严格控制每一步的操作，确保标准品的稀释系列是准确的。
此外，为了避免污染，制备过程中需要使用无核酸酶的纯水和无核酸酶的试剂。
三、绝对定量PCR标准品的储存。
制备好的绝对定量PCR标准品需要进行分装和储存。
为了确保标准品的稳定性和准确性，我们需要将其分装成小份，并在-20℃或更低温度下储存。
在分装和储存过程中，需要注意避免反复冻融和长时间曝光于室温下，以免影响标准品的稳定性。
四、绝对定量PCR标准品的应用。
制备好的绝对定量PCR标准品可以用于建立标准曲线，进而用于绝对定量PCR实验中目标DNA或RNA的绝对数量测定。
在使用标准品建立标准曲线时，需要按照一定的浓度梯度进行稀释，并进行PCR扩增。
通过测定PCR扩增产物的Ct值，我们可以绘制标准曲线，并据此将待测样本的Ct值转化为目标DNA或RNA的绝对数量。
绝对定量PCR标准品在绝对定量PCR实验中起着至关重要的作用，它的选择、制备、储存和应用都需要严格控制和操作。
只有在标准品的质量可靠、稳定性好的情况下，我们才能获得准确可靠的绝对定量PCR实验结果。
绝对定量简易操作流程
绝对定量简易操作流程applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程绝对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程绝对定量实验简易操作流程1.双击桌⾯图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进⼊主界⾯后选择Advanced Setup 。
2.进⼊Setup下的Experiment Properties界⾯：2.1输⼊实验名称（Experiment Name）2.2选择仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5选择运⾏模式3.进⼊Setup下的Plate Setup界⾯，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界⾯中设置基因及样本。
利⽤按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的⾮荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利⽤其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利⽤按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边界⾯中进⾏样品板的排布。
利⽤⿏标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利⽤⿏标单选或拖曳以选择反应孔（⼀般情况下，每个梯度设置三个副孔），⽽后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输⼊拷贝数。
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
2 19-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf
绝对定量实验操作1.设计实验：a.指定未知样本，准备标准曲线，并确定重复数。
b.使用Primer Express（引物设计）软件设计引物和探针。
2.提取总RNA:3.使用High Capacity cDNA Archive Kit（大容量cDNA库试剂盒）从总RNA生成cDNA：a.准备反转录(RT)预混试剂。
b.向反应板的每个反应孔中吸取以下体积的液体，准备cDNA库反应板：50μL反转录(RT)预混试剂30μL无核酸酶水20μL RNA样本确保对于每次50μL PCR扩增反应，从总RNA转化为cDNA的质量为10至100ng，体积5μL。
c.使用为两步法或一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法给出的各项参数值，设计热循环。
d.在−20°C温度下贮存cDNA，直到使用时。
4.准备PCR扩增预混试剂。
5.准备反应板：a.在反应板上作上标签，确保为每个目标序列包括一组标准样本。
标准样本必须与目标序列同在一个反应板上。
b.吸取50μL适当的PCR扩增预混试剂（含cDNA），滴入反应板的每一个反应孔中。
c.将反应板置于冰上直到准备好将其装入定量PCR仪。
6.创建绝对定量反应板文件：a.选择File>New。
b.从Assay下拉列表中，选择Absolute Quantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线），然后单击Next>。
注意：不能使用相对定量(RQ)反应板文件执行绝对定量(AQ)实验分析，反之亦然。
存储在绝对定量和相对定量反应板文件中的信息不可互相交换。
c.将探针添加到反应板文件中，然后单击Next>。
d.为每个孔指定探针和任务，然后单击Finish。
7.在Well Inspector窗口（依次选择View>Well Inspector）中，输入样本名。
8.开始绝对定量(AQ)程序：a.选择Instrument选项卡。
默认情况下，显示两步法反转录-聚合酶链反应方法中PCR步骤的标准PCR条件。
219-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf
219-荧光定量PCR仪绝对定量实验操作pdf绝对定量实验操作1.设计实验：a.指定未知样本，准备标准曲线，并确定重复数。
b.使用Primer Express（引物设计）软件设计引物和探针。
2.提取总RNA:3.使用High Capacity cDNA Archive Kit（大容量cDNA库试剂盒）从总RNA生成cDNA：a.准备反转录(RT)预混试剂。
b.向反应板的每个反应孔中吸取以下体积的液体，准备cDNA库反应板：50μL反转录(RT)预混试剂30μL无核酸酶水20μL RNA样本确保对于每次50μL PCR扩增反应，从总RNA转化为cDNA的质量为10至100ng，体积5μL。
c.使用为两步法或一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法给出的各项参数值，设计热循环。
d.在?20°C温度下贮存cDNA，直到使用时。
4.准备PCR扩增预混试剂。
5.准备反应板：a.在反应板上作上标签，确保为每个目标序列包括一组标准样本。
标准样本必须与目标序列同在一个反应板上。
b.吸取50μL适当的PCR扩增预混试剂（含cDNA），滴入反应板的每一个反应孔中。
c.将反应板置于冰上直到准备好将其装入定量PCR仪。
6.创建绝对定量反应板文件：a.选择File>New。
b.从Assay下拉列表中，选择Absolute Quantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线），然后单击Next>。
注意：不能使用相对定量(RQ)反应板文件执行绝对定量(AQ)实验分析，反之亦然。
存储在绝对定量和相对定量反应板文件中的信息不可互相交换。
c.将探针添加到反应板文件中，然后单击Next>。
d.为每个孔指定探针和任务，然后单击Finish。
7.在Well Inspector窗口（依次选择View>Well Inspector）中，输入样本名。
8.开始绝对定量(AQ)程序：a.选择Instrument选项卡。
绝对定量
Applied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries.
Authorized Thermal Cycler
This instrument, Serial No___________, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. HoffmannLa Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal research and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404.
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程英文回答：Lymphocyte Subset Absolute Count Protocol.Principle:Lymphocyte subset absolute count is a quantitative analysis of lymphocyte subpopulations, such as CD3+, CD4+, CD8+, and CD19+ cells, in a blood sample. This procedure is used to assess the immune system's composition and function, particularly in conditions involving immune dysregulationor infection.Materials:Blood sample.Flow cytometry analyzer.Fluorochrome-conjugated antibodies specific for lymphocyte subpopulations.Lysis buffer.Wash buffer.Absolute counting beads.Procedure:1. Sample Preparation:Collect a blood sample into a tube containing an anticoagulant.Centrifuge the blood sample at 300 x g for 10 minutes.Remove the plasma and wash the cells with PBS.Lyse the red blood cells with lysis buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.2. Antibody Staining:Aliquot the cells into tubes.Add fluorochrome-conjugated antibodies specificfor each lymphocyte subpopulation.Incubate the cells at room temperature in the dark for 15-30 minutes.3. Washing:Wash the cells twice with wash buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.4. Absolute Count:Add absolute counting beads to the cell suspension.Acquire a flow cytometry data file.Gate on the lymphocyte population using forwardand side scatter.Use the absolute counting beads to calculate the absolute count of each lymphocyte subpopulation.Calculation:The absolute count of each lymphocyte subpopulation is calculated using the following formula:Absolute Count = (Event Count / Number of Beads) x (Bead Concentration)。
7500Fast_操作流程
7500Fast Real Time PCR简易操作流程（供参考）
1.打开电脑，等待WinXP桌面完全显示后打开7500Fast主机电源。
2.等待7500Fast主机“Power”指示灯稳定后，打开SDS软件。
3.创建绝对定量反应板文件：
a.选择Create New Document；
b.从Assay下拉列表中选择Absolute Quantification，然后单击
Next；
c.选择（或创建）所需探针加入到反应板文件中，然后单击Next；
d.为每个反应孔指定探针和任务，为标准品赋值，然后单击Finish；
4.选择Setup选项卡，选中样品对应的反应孔，在Well Inspector窗口
中输入样品名，并检查探针和任务设置；
5.选择Instrument选项卡，设定PCR条件、反应体系；
6.选择File 〉Save as，保存反应板文件为***.sds；
7.放入样品板（管），单击Start开始反应程序（八连管、单管请使用
光学平盖），等待软件倒计时开始后再离开。
8.程序运行结束后，选择Results选项卡〉Amplification plot选项卡，
选择Auto Ct分析方法，点击Analysis 〉Analyze进行分析，选择Report选项卡查看结果。
9.选择File 〉Export，导出所需结果。
10.关机顺序：关闭SDS软件，关7500Fast主机，关电脑。
定量PCR实验操作流程
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五：实验操作
• 前期准备
• 为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验 的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理 过的离心管及其移液枪头，同时实验操作 时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验 操作尽可能在冰上进行。
五：实验操作
• RNA抽提
• 样品处理
• 贴壁细胞，去培养基后可直接加入 TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反 复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中； • （Note：如为悬浮细胞，先离心收集，加入 TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复 吹打裂解细胞，如为新鲜组织样品，可取50mg～ 200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一 定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解 组织细胞）。
Total
7 μl
20 μl *3
*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能 较差时，可以在0.2～1.0 μ范围内调整引物浓度。 *2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过 PCR反应液总体积的10%。 *3 建议反应液体积为20 μl。（节省试剂，最低可降至15 μl）
五：实验操作
• RNA抽提
• 相分离 • 室温放置上述样品液10min左右后，每 1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子， 剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后 12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出 样品，通过观察可以发现样品分三层，其 中最上层含有RNA样品。
五：实验操作
实验操作?rna抽提?相分离?室温放置上述样品液10min左右后每1mltrizol中加入氯仿为200l盖上盖子剧烈振荡约1min室温静置5min然后12000g冷冻离心15min4小心取出样品通过观察可以发现样品分三层其中最上层含有rna样品
StepOneV2.X 绝对定量简易操作流程
applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOneSoftware> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2选择仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5选择运行模式3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷贝数。
定量分析的基本操作
定量分析的基本操作第二章定量分析的基本操作在分析化学实验中，用到的玻璃仪器种类很多，按用途大体可分为（1）容器类，如烧杯、烧瓶、试剂瓶等，根据它们能否受热又可区分为可加热的和不宜加热的器皿；（2）量器类，如量筒、移液管、滴定管、容量瓶等；（3）其他玻璃器皿，如冷凝管、分液漏斗、干燥器、分馏柱、标准磨口玻璃仪器等，其中标准磨口玻璃仪器主要用于有机实验。
第一节常用的玻璃仪器的洗涤与烘干玻璃仪器的洗涤方法有很多，一般来说，应根据实验的要求、玻璃仪器受污染的程度以及所用的玻璃仪器的种类选择合适的方法进行洗涤。
实验中常用的烧杯、锥形瓶、量筒、量杯等一般的玻璃器皿，由于测量精度较差，可用毛刷蘸水直接刷洗，能去掉仪器上附着的尘土、可溶性的杂质和易脱落的不溶性的杂质；如果玻璃器皿上附着有机物或受污较为严重，可用毛刷蘸去污粉或合成洗涤剂刷洗，再用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水或去离子水润洗三次，去掉自来水带来的一些无机离子。
带有精确刻度的容量器皿如滴定管、移液管、吸量管、容量瓶等，为了保证容积的准确性，不宜用刷子刷洗，应选择合适的洗液来洗涤，先用自来水冲洗后，沥干，再用洗液处理一段时间（一般放置过夜），然后用自来水清洗，最后用蒸馏水（或去离子水）冲洗3次。
具体操作如下：滴定管洗涤：选择合适的洗涤剂和洗涤方法。
一般用自来水冲洗，零刻度线以上部位可用毛刷蘸洗涤剂刷洗，零刻度线以下部位如不干净，则采用洗液洗(碱式滴定管应除去乳胶管，用乳胶头将滴定管下口堵住)。
少量的污垢可装入10mL洗液，双手平托滴定管的两端，不断转动滴定管，使洗液润洗滴定管内壁，操作时管口对准洗液瓶口，以防洗液外流。
洗完后，将洗液分别由两端放出。
如果滴定管太脏，可将洗液装满整根滴定管浸泡一段时间。
为防止洗液漏出，在滴定管下方可放一个烧杯。
最后用自来水、去离子水（或蒸馏水）洗净。
洗净后的滴定管内壁应被水均匀润湿而不挂水珠。
容量瓶的洗涤：先用自来水刷洗内壁，倒出水后，内壁如不挂水珠，即可用蒸馏水刷洗备用，否则必须用洗液洗。
iTRAQ技术
同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ 技术）简介：iTRAQ 技术（同位素相对标记与绝对定量技术）是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术能够得到：一般500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质表达的差异。
。
i TRAQ 试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。
应用：• 同时标记8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量 • 非常高的通量• 可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测，• 可以分析详细分期／型的临床疾病样本，并可设计样本重复• 甚至可以进行个体样本的研究• 细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学技术特点和优势• 定量敏感、反应速度快• 标记完全，标记效率高达97%以上• 较高的重复性，能简化谱的复杂程度、提高离子强度• 可对多达八种不同样本同时进行定量分析• 定性与定量同时进行实验大致流程：操作时首先是对不同蛋白质样品分别进行酶解，并采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合，结合多维色谱分离和后续的串联质谱鉴定，从而实现对不同来源样品蛋白进行分离和鉴定的目的，我们可以提供8重标记iTRAQ 标记，可以对多达8种不同样本同时进行定量分析。
原理：i TRAQ 试剂包含八种不同的胺活性试剂。
每种胺活性试剂与水解后肽段结合。
胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。
下图为整个的实验流程：1.不同的蛋白质样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8,首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）.2.采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合。
3.使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱。
4.8个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰。
5.对加入标记的肽段进行二级质谱，这时，平衡基团从报告基团上脱落。
6.二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119和121，其强度分别代表8个标记的样品的同一个肽段。
7900绝对定量实验简易操作流程
applied biosystems 7900HT荧光定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程SDS 2.47900HT定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标开启SDS software或从Start >All Programs > AppliedBiosystems > SDS 2.4> SDS 2.4开启软件。
2.进入SDS software 后出现Login 窗口，输入用户名和密码，或以administrator 登入（无须键入密码），按OK 进入软件。
3.点选或从“File”下选择“New”，将会出现如下窗口：Assay：选择Standard Curve (AQ)Container：根据反应板类型，选择96-well Plate ，384-well Plate或384-well Taqman Low Density ArrayTemplate：Blank Template (若有之前已设好的Template，点击Browse可导入模板) 。
Barcode：可使用扫描器记录样品板条形码，如果没有条码此项留空白。
3.1按OK，即出现Plate Document。
①在Setup 窗口下点“Add Detector”即会弹出Detector Manager，②若有已设定的Detectors，选中待检测的Detector，③点击Copy to Plate Document，④点击Done完成添加。
3.2设定新的Detector：①在Detector Manager中点击“New”，②进入“AddDetector”窗口设置Detector，③点击“OK”完成detector设置。
Name：输入基因名称。
Reporter：选择所使用的报告荧光。
Quencher：如果使用MGB探针或SYBR染料则选None Fluorescent；若探针淬灭基团为TAMRA则选择TAMRA。
定量PCR操作流程
双击该图标，打开软件出现此界面，确认选择为第一个（Quantitative PCR），点击OK此处3个按钮，自左向右依次为设置、运行、分析选中实验中所用的孔，与仪器上相对应随后在Well type的下拉选框里选择相应的Unknown（待测样本）、NTC（阴性对照）、Standard（标准品）。
理论上试剂盒带4个浓度的标准品，每次实验使用。
阴性对照设置1个。
选中Unknown孔，随后在Collect Fluorescence data 下面的FAM打上勾。
对Standard、NTC做同样的操作接下来，对标准品进行赋值。
目前显示未赋值的情况，可以看见每一个Standard显示均为0选中其中一个Standard（标准品）孔，在Standard quantity右侧的方框里填入相应的值。
比如，试剂盒提供的第一个标准品浓度为50000，就在方框内填入。
此时面板上的孔里也显示相应的值。
依次对剩下的3个标准品进行赋值，如图所示，4个标准品孔分别代表50000-50000000的4个浓度。
点击此标签，进入程序设置界面。
可根据试剂盒的说明进行设置。
一般，有UNG 酶启动和预变性两步。
如图示最左方50度表示UNG 酶消化，95度表述预变性每个步骤的温度显示在横线下方，上方为时间如果试剂盒说明为2步法扩增，则表示95度和60度两个温度，选择Normal 2Step 。
如果为3步法扩增，则表示95度、55度和72度三个温度选择Normal 3Step 。
当板、程序全部设置完全后，点击Run进入运行界面。
点击Start点击Start会弹出此保存对话框选择合适的路径，保存实验结果，并开始实验。
实验结束后无需再次保存。
快速导入模板方法假如已有实验结果，日后进行同类实验时可直接使用Import（模板导入）功能。
点击Import弹出此对话框，找到作为模板的文件，打开即可导入板设置。
快速导入模板功能导入程序设置方法：选择Custom，点击Import，按前述方法导入模板的程序设置在Analysis结果分析界面下，选择扩增曲线Amplification观察扩增曲线选择Standard curve 可以观察标准曲线的相关系数（Rsq），扩增效率（Eff）。
7500Fast_操作流程
7500Fast Real Time PCR简易操作流程（供参考）
1.打开电脑，等待WinXP桌面完全显示后打开7500Fast主机电源。
2.等待7500Fast主机“Power”指示灯稳定后，打开SDS软件。
3.创建绝对定量反应板文件：
a.选择Create New Document；
b.从Assay下拉列表中选择Absolute Quantification，然后单击
Next；
c.选择（或创建）所需探针加入到反应板文件中，然后单击Next；
d.为每个反应孔指定探针和任务，为标准品赋值，然后单击Finish；
4.选择Setup选项卡，选中样品对应的反应孔，在Well Inspector窗口
中输入样品名，并检查探针和任务设置；
5.选择Instrument选项卡，设定PCR条件、反应体系；
6.选择File 〉Save as，保存反应板文件为***.sds；
7.放入样品板（管），单击Start开始反应程序（八连管、单管请使用
光学平盖），等待软件倒计时开始后再离开。
8.程序运行结束后，选择Results选项卡〉Amplification plot选项卡，
选择Auto Ct分析方法，点击Analysis 〉Analyze进行分析，选择Report选项卡查看结果。
9.选择File 〉Export，导出所需结果。
10.关机顺序：关闭SDS软件，关7500Fast主机，关电脑。
定量PCR加样操作流程
定量PCR加样操作流程定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于精确测定目标DNA 或RNA分子在样本中的相对或绝对含量的技术。
在定量PCR实验中，需要进行一系列加样操作，以确保正确反映目标分子的浓度。
下面将详细介绍定量PCR的加样操作流程。
1.设计引物和探针：在进行定量PCR之前，需要设计一对引物和一种探针，用于扩增和检测目标分子的特定序列。
引物和探针的设计需要考虑到特异性和效率，并且应该使扩增产物的大小恰好在所需范围内。
2.准备实验材料：在进行定量PCR之前，需要准备一系列实验材料，包括：-收集所需的引物和探针；-准备PCR反应液，包括缓冲液、dNTPs、酶、MgCl2和DNA模板等；-防护用品，如手套和护目镜，以确保实验操作的安全性。
3.制备PCR反应体系：根据PCR反应的种类和厂家提供的建议，按照实验方案准备PCR反应液。
反应液通常由多个组分组成，其中包括DNA模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2和水。
4.为每个样品制备PCR反应管：为每个样品准备PCR反应管，确保每个反应管都包含相同的PCR反应液。
如果有多个样品需要测试，可以通过分装PCR反应液到每个反应管中来实现。
5.添加DNA模板：在每个PCR反应管中，将一定体积的DNA模板加入到PCR反应液中。
DNA模板的体积应当根据所用方法和预期浓度来确定。
6.加入引物和探针：根据引物和探针的设计，向每个PCR反应管中加入适量的引物和探针。
确保每个反应管都包含相同浓度的引物和探针。
7.混匀反应液：通过轻轻的振动或轻微的离心来混合PCR反应液，以确保其中的各个组分均匀混合。
8.加盖或密封反应管：将PCR反应管盖上或用密封膜密封，以防止反应过程中的污染和蒸发。
9.进行PCR扩增：将PCR反应管置于热循环仪中进行PCR扩增。
根据实验方案设置PCR程序，包括预扩增步骤、扩增步骤和终止步骤。
10.数据分析和解读：在PCR扩增完成后，可以使用荧光定量PCR仪测量每个反应管中荧光信号的强度。
荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
荧光定量P C R之绝对定量分析——标准曲线的绘制1. 绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量2. 绝对定量标准品标准品的一些标准* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法：1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4. 实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制（1cycle=1min）设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照PCR反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7=50118 copies核酸拷贝数的计算一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸浓度＝(OD260)×(dilution factor)×[33或40或50]=ng/ulMW代表克/摩尔，单位dolton：1dolton即表示1g/mol1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)ssDNA = (碱基数)×(330道尔顿/碱基) ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)得到拷贝数计算公式：(6.02x1023拷贝数/摩尔)×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml.即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例：3000碱基质粒，浓度100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔数copy数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……如何计算拷贝数？计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔) ×(浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml[平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]。
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程英文回答：Lymphocyte subset absolute count is a laboratory test that measures the number of different types of lymphocytes in the blood. Lymphocytes are a type of white blood cells that play a crucial role in the immune system. They help the body fight off infections and diseases.The process of obtaining lymphocyte subset absolute count involves several steps. Here is a general outline of the procedure:1. Patient preparation: The patient may be asked to fast for a certain period before the test, usually overnight. This is to ensure accurate results.2. Blood sample collection: A healthcare professional will collect a blood sample from the patient. The most common method is venipuncture, where a needle is insertedinto a vein, usually in the arm, and blood is drawn into a collection tube.3. Sample processing: The blood sample is then sent to the laboratory for processing. The sample is centrifuged to separate the different components of blood, including the lymphocytes.4. Lymphocyte subset analysis: The separated lymphocytes are then analyzed using flow cytometry, a technique that uses fluorescently labeled antibodies to identify and quantify different lymphocyte subsets. Commonly measured subsets include CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer (NK) cells.5. Absolute count calculation: The flow cytometry data is used to calculate the absolute count of each lymphocyte subset. This is done by multiplying the percentage of each subset by the total lymphocyte count obtained from a complete blood count (CBC) test.6. Result interpretation: The calculated absolutecounts are then reported to the healthcare provider. The results are typically given in cells per microliter(cells/μL) of blood.Lymphocyte subset absolute count is an important testin diagnosing and monitoring various medical conditions, including immune disorders, infections, and certain typesof cancer. It provides valuable information about thestatus and function of the immune system.中文回答：淋巴细胞亚群绝对计数是一种实验室检测方法，用于测量血液中不同类型淋巴细胞的数量。
绝对定量 计算公式
绝对定量计算公式绝对定量（Absolute Quantification）是一种实验方法，用于测量样本中特定成分的精确数量。
在生物技术和生命科学领域中，这种方法被广泛应用于基因表达分析、蛋白质组学研究和代谢组学研究等领域。
绝对定量的计算公式可以帮助研究人员精确地计算样本中特定成分的数量。
绝对定量实验通常基于标准曲线法。
首先，通过标准品（已知浓度的标准物质）建立标准曲线，将标准品的浓度与其对应的信号值（例如，荧光强度、吸光度等）进行关联。
然后，将待测样本的信号值与标准曲线进行比较，从而确定待测样本中特定成分的浓度。
绝对定量的计算公式通常基于以下步骤：建立标准曲线：通过标准品建立标准曲线，将标准品的浓度与其对应的信号值进行关联。
一般采用线性回归分析方法拟合数据，得到标准曲线的方程。
测量待测样本的信号值：对待测样本进行实验处理，测量其信号值（例如，荧光强度、吸光度等）。
计算待测样本的浓度：将待测样本的信号值代入标准曲线的方程，计算出待测样本中特定成分的浓度。
绝对定量的计算公式可以表示为：[待测样本浓度] = [标准曲线方程] × [待测样本信号值]其中，[标准曲线方程]是通过标准品建立的方程，表示标准品的浓度与其信号值之间的关系；[待测样本信号值]是待测样本的实验测量值；[待测样本浓度]是待测样本中特定成分的浓度。
值得注意的是，绝对定量的计算公式可能会因为实验方法、仪器和试剂的不同而有所差异。
因此，在使用不同的实验方法和仪器时，应该根据具体情况进行适当的调整和验证。
同时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，建议对实验过程进行质量控制和数据验证。
总之，绝对定量是一种重要的实验方法，可以帮助研究人员精确地测量样本中特定成分的数量。
通过建立标准曲线和正确使用计算公式，可以获得可靠的实验结果，为生物技术和生命科学研究提供有力支持。
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applied biosystems StepOne/StepOnePlus
荧光定量PCR仪
绝对定量实验简易操作流程
绝对定量实验简易操作流程
SDS 2.2
StepOne/StepOnePlus定量PCR仪
绝对定量实验简易操作流程
绝对定量实验简易操作流程
1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne
Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：
2.1输入实验名称（Experiment Name）
2.2选择仪器型号
2.3
2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve
2.4选择试剂种类
2.5选择运行模式
3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：
3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新
的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择
反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三
个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷
贝数。
按照相同的操作，完成标准曲线其他数据点的设置。
（建议设置5个梯度）
4. 在Setup 下的Run Method 界面中，设定反应条件。
5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM
Block 温度梯度功能，需要先在
界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。
此时Block 即被
分成六个区块。
（此功能仅限StepOnePlus 机型)
然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，
在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。
两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。
6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然
后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。
7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：
7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。
如果
想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
7.2查看标准曲线时，可通过更改Plot Settings来改变标准曲线的显示方式。
Eff%代表扩
增效率。
R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，建议在0.99以上。
7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。
黄色三
角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。
8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。
若想存
储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。