福建省鼠类感染巴尔通体调查及序列分析

福建省鼠类感染巴尔通体调查及序列分析肖方震;林代华;周淑姮;徐国英;邓艳琴【摘要】目的了解福建省鼠类中巴尔通体(Bartonella spp.)的感染状况和基因特征.方法 2014-2016年采用笼日法在福建省闽东、闽西、闽南、闽北和闽中捕鼠,现场鉴定并记录捕获鼠类的采集时间、地点、鼠种、性别、鼠龄等资料.采集鼠心脏血,PCR扩增巴尔通体的gltA和16S～23S rRNA基因,阳性PCR产物送测序并进行序列比对分析,构建系统进化树.感染率间的比较采用x2检验或Fisher精确检验法.结果调查共布放鼠笼5 917笼次,捕鼠381只,鼠密度为6.44％.巴尔通体感染率为12.34％.家鼠的巴尔通体感染率为10.61％,褐家鼠(Rattus norvebicus)和黄胸鼠(Rattus flavi pectus)感染率分别为11.30％和10.00％;野鼠的感染率为13.86％,黄毛鼠(Rattus losea)和针毛鼠(Rattus fulvescens)感染率分别为22.86％和18.00％,野鼠的巴尔通体感染率高于家鼠的感染率,但无统计学意义.从地区分布看,闽西、闽北一带的感染率较高,分别为20.00％和25.33％.闽南一带感染率最低,为0.各地区感染率存在统计学意义(P＜0.05).不同性别、鼠龄的巴尔通体感染率差异无统计学意义,而不同的生境下的感染率存在统计学差异(P＜0.05).阳性样本测序分析显示,福建省鼠类感染的巴尔通体序列与B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii序列最接近.结论福建省鼠类存在巴尔通体感染,存在对人群致病的风险.%We explored the status of Bartonella infection in rodents and the sequence characteristics of Bartonella in Fujian Province.Rodents in Fujian Province were captured by the night trapping method during rmation of the captured rodents on capturing dates and geographic locations,species,gender and ages were recorded.Heart blood samples were collected,from which the fragments of ghA gene and16S-23S rRNA gene of Bartonella were amplified by polymerase chain reaction (PCR).The PCR products were sequenced and the phylogenetic tree was constructed for homology analysis by biological analysis software.Data on infection rate were analyzed with Chi-square or Fisher exact test to indicate statistical significance.Results showed that 5 917 cages were laid and 381 rodents were captured,density of rodent was 6.44％.The overall Bartonella infection rate in rodents was 12.34 ％,while infection rate in domesticated rodents was 10.61％,with 11.30 ％ in Rattus norvebicus and 10.00％ inR.flavipectus.And the infection rate in wide rodents was 13.86％,with a rate of 22.86％ in Rattus losea and 18.00％ in R.fulvescens,respectively.The infection rate was higher in wild rodents than in domesticatedrodents,however,no significant difference was found.The Western Fujian and Northern Fujian region had the higher infection rates of 20.00％ and 25.33％,and no infection was found in Southern Fujian region.The statistical analysis result revealed that a significant difference in infection rate among different region and habitats,but no significant difference in infection rate between male and female rodents,or among different ages.The BLAST results revealed the species to beB.tribocorum,B.elizabethae and B.grahamii.In conclusion,Bartonella infection is found in the rodents in Fujian Province and more attention should be paid on its impact on public health in the province.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2017(033)007【总页数】6页(P607-612)【关键词】巴尔通体;鼠类;基因特征;福建【作者】肖方震;林代华;周淑姮;徐国英;邓艳琴【作者单位】福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福州350001;福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福州350001;福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福州350001;福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福州350001;福建省疾病预防控制中心,福建省人兽共患病研究重点实验室,福州350001;福建医科大学,福州 350004【正文语种】中文【中图分类】R37巴尔通体(Bartonella spp.)是一群革兰氏染色阴性菌，属于变形菌纲、α亚纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属。

目前至少有26个种和亚种[1]，其中超过半数与鼠类有关[2]。

巴尔通体可引起人的战壕热、猫抓病、心内膜炎、菌血症和杆菌性血管瘤等疾病，尤其在免疫功能低下的人群，如HIV患者极易感染。

近年由于各种巴尔通体引起的心内膜炎、菌血症等病例日益增多, 因此受到广泛的关注。

目前我国的云南、内蒙古、浙江等省份陆续对鼠类感染巴尔通体开展了调查[3-5]，福建对家鼠开展过调查，但野鼠未见报道，本调查较为完整地对福建省不同地区的家鼠和野鼠开展调查，以了解福建省鼠类携带巴尔通体状况并进行基因鉴定和分析。

1.1 标本来源 2014-2016年相继在福建的长乐、德化、福安、古田等11个地区捕捉家栖鼠和野鼠，调查地点涵盖了福建省的东西南北中不同地理区域，即闽东、闽西、闽南、闽北和闽中。

捕鼠采用笼日法,鼠笼晚放晨收。

现场鉴定鼠种,填写调查表，记录每只鼠的相关信息包括编号、釆集时间、地点、生境、鼠种、鼠龄、雌雄等。

同时将捕获的鼠放入鼠袋内,经乙醚麻醉后,消毒，心脏采血。

共采集了381份鼠的全血样本，置于-80 ℃保存。

1.2 DNA提取使用血液基因组DNA提取试剂盒(厦门泰京生物技术有限公司)提取样本DNA，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 PCR扩增参考相关文献在gltA基因[6]和16S～23S rRNA基因间隔区(ITS)[7]分别设计一对引物。

其中gltA基因设计引物为BhCS781.p:5′-GGG GAC CAG CTCATG GTG G-3′，BhCS1137.n:5′-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3′。

在16S～23S rRNA基因间隔区设计引物为TIIe.455p:5′-GCT TGT AGC TCA GTT GGT TAG-3′，TALa.885n:5′-TGC TTG CAA AGC AGG TGC TCT-3′PCR扩增反应体系中含有Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、DNA模板3 μL，加无菌去离子水至总体积25 μL。

引物BhCS781.p和BhCS1137.n 反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s、循环30次，72 ℃总延伸5 min。

引物TIIe.455P和TALa.885n 引物的条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s、55 ℃退火50 s，72 ℃延伸20 s、循环30次，72 ℃总延伸5 min。

两对引物均为阳性，判定为阳性，若仅一对引物阳性则认为阴性。

首份PCR阳性标本送上海生工生物技术公司测序，经序列比对，确定为巴尔通体，其后的标本检测以此作为阳性对照。

为避免发生假阳性反应，DNA模板提取、PCR反应、电泳均在不同的房间操作，同时每次反应均设有阴性对照。

1.4 产物检测取5 μL反应产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，90 V 40 min，凝胶成像系统观察结果。

采用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，参照试剂盒说明书进行，纯化后送上海生工生物技术公司进行测序。

1.5 DNA序列分析测序得到的DNA序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST，与相似的序列进行同源性分析。

同时应用BioEdit软件对序列进行剪接，应用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.6 统计学处理所有数据均采用SPSS 18.0 统计软件进行处理，率的比较采用四格表χ2检验、行列表χ2检验和Fisher’s确切概率法，P<0.05表示有统计学意义。