甲胎蛋白基因在转录水平上的检测

AFP基因的DNA结构
AFP基因约为20 kbp大小, 由15个内含子和14
个外显子组成, 包含590个氨基酸, 其中在N末端有 19个氨基酸是信号肽序列。
实验方法
1、 Northern印记杂交 2、核糖核酸酶保护试验
3、原位杂交
4、RT－PCR技术 5、实时荧光定量PCR
Northern印迹杂交实验原理
引物设计的原则
1、长度及碱基分布 2、引物之间及引物自身 3、引物3’端 4、引物5’端
5、二级结构区
6、简ห้องสมุดไป่ตู้引物
结果分析
1、若有AFP基因表达，则在与其反转录
CDNA链分子量平行处应有检测信号。
2、若AFP基因未表达，则在与其反转录
CDNA链分子量平行处没有检测信号。
。
应用
1、分析基因的表达
1、掌握Northern印迹杂交和RT－PCR 技术的方法 2、了解实验的操作方法和步骤
3、判断基因在转录水平的表达情况
甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)
甲胎蛋白是肿瘤相关的胚胎特异α-球蛋 白,分子量约为70 kDa，是一直以来都被认为 是临床诊断胎儿出生缺陷和肝细胞癌的经典肿 瘤标志物。正常情况下．这种存在于胚胎早期 血清中的甲胎蛋白在出生后就迅速消失，如果 重现于成人血清中．则提示有肝癌的可能。
2、反转录ｃDNA链
3、PCR扩增 4、凝胶电泳
5、结果显示
反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转 录酶 2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶。 4．MMLV反转录酶的RNase H突变体
检测甲胎蛋白基因在转 录水平上的的表达情况
讨论的题目
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: NM_001134.1)的异常表 达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根 据基因表达的检测方法，设计实验方案从转 录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括： 实验目的、实验方法及原理、技术路线、可 能的结果分析及应用等。
2、获取目的基因 3、合成CDNA探针
Northern印迹杂交与PCR方法的比较
Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感 性较PCR技术低，但其特异性强，假阳性率低，因此被
认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，
使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
结果分析
1、若出现明显杂交带，则表明细胞组 织内有AFP基因的表达，则会有患肝癌的风险。 2、若没有出现明显杂交带，则表明细 胞组织内基因未表达。
应用
Northern印记技术多用来检查基因组 中某个特定的基因是否得到转录以及转录 的相对水平。目前，Northern印记技术仍 然被认为是检测基因表达水平的金标准。
RT-PCR技术实验原理
逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首 先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为 模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成 cDNA，
再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。
试验技术路线
1、提取mRNA
Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离 后，将其转移到固相支持物上，然后利用杂交反 应来鉴定其中特定mRNA 分子的含量及其大小的 过程。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称 为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印 迹技术则被称为Western blot。
实验技术路线
1、提取mRNA 2、琼脂糖凝胶电泳分离RNA 3、Northern印迹转移前的凝胶预处理 4、Northern印迹转移 5、用标记的RNA探针与转移到固相支持物 上的核酸片段进行杂交 6、杂交结果的显示