体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术

●体外细胞培养条件和基本技术

●体外细胞培养

●体外培养物的生长生物学

●细胞系和细胞株

●培养物的冷冻与复苏

●培养物的污染、检测和排除

●一、体外细胞培养条件和基本技术

体外细胞培养的优缺点

优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。

体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。

一、体外细胞培养条件

（一）、体外培养实验室

1. 准备室

2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。

3. 缓冲室

4. 其他实验室

（二）、体外培养的设备和器具

设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值

3. 倒置显微镜

4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，

超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置

8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平

培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，

针头式加压塑料小滤器

2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿

（4）多孔培养板（5）离心管

3. 移液器

4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网

（三）培养用液

•水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS)

水：离子交换水，蒸馏水

平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖

常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks •培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液

2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等

3.无血清培养基：

干粉型培养基的配制：1）. 制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水2）. 加温水至15-30℃之间3）. 加干粉入水中，搅拌令之溶解4）. 加NaHCO3 5）. 加水至最终量6）. 必要时用1N HCl或1N NaOH调节pH，因滤过时pH 可能受影响7）. 用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消毒

•其他用液：消化液等

1.消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液

2.pH 调整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液

3.抗生素液：青链霉素

常用的生长培养液：基本培养基80-90％

血清(多用小牛血清) 10-20 ％

抗生素(多用青霉素100单位／毫升和链霉素100微克／毫升

一、细胞体外培养的其它条件

一）、无污染的气、液相环境：1、O2 （5%CO2 + 95% 空气，O2: 21%）

2、CO2- pH

3、液相环境-渗透压

二）、温度

三）、生长基质1、多聚赖氨酸：0.05mg/ml 2、纤维连接蛋白：1mg/ml 3、胶原：1~3mg/ml 4、层粘连蛋白：5~10 g/ml

一、清洗和消毒

1.1玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗

浸酸液：强液：63克重铬酸钾，1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馏水。

次强液：120克重铬酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。

弱液：100克重铬酸钾，100毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。

胶塞清洗：胶塞入水中浸泡→2％Na0H煮沸10-20分钟→自来水冲洗→1％稀盐酸浸泡30分钟→自来水冲洗和蒸馏水漂洗2-3次，晾干备用

1.2塑料器皿的清洗：

2.包装：局部包装；全包装

3.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用

二、体外细胞培养

体外细胞培养类型：原代培养，继代培养

一）、基本流程：１mm3的植块→植块培养

原代培养：↗

动物器官或大组织块→洗去血污→剔除多余成分

↙

组织剪碎→蛋白酶消化→机械吹打→铜网过滤→

离心→细胞悬液→调整细胞数→分离细胞培养二）、实验要点：

1、常用实验材料的取材：胚胎、组织、人体手术或活检材料

2、分散细胞的方法：

１）. 机械解离细胞法：吸管吹打法,过筛法,单细胞分离器

２). 蛋白酶学处理法: 胰蛋白酶, 胶原酶

３). 螯合剂解离细胞法: EDTA , 柠檬酸钠

3、接种和培养过程:：

１）. 植块培养：接种与培养：

优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。

２）.分散细胞培养：操作过程:

优点：解除了植块内部细胞间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。

4、讨论和注意事项

⏹相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。

⏹对于大多数贴壁依赖型细胞来说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是

决定培养物生长快慢的关键步骤。可选用生长基质表面；降低浮力。

⏹细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。

三）、原代细胞培养的注意事项

1、培养液：培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。

2、培养的空间：通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。

一、原代培养物需要传代的指标:

继代培养

1、植块培养;

2、分离细胞培养物;

3、悬浮细胞培养物

二、传代的过程

1、主要材料：

（1）蛋白酶消化液；（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液

2、方法：

（1）贴壁生长细胞培养物的传代：

吸去旧培养液→PBS 或D-Hanks洗→酶消化解离细胞→终止消化→吹打培养器皿底部→收集细胞、洗涤、调整细胞数→接种

（2）悬浮培养物的传代：

培养物移入离心管→离心、去上清→培养液重悬→接种培养皿→补加培养液

三、传代培养的注意事项

1、传代的时机与再培养的细胞密度

2、传代数与培养物的生长

●三、体外培养物的生长生物学

一、培养细胞的生长与增殖

⏹原代培养期：细胞性状与体内原组织相似性大，异质性。

⏹传代培养期：细胞增殖旺盛（潜伏期、指数生长期、停滞期），逐渐趋

向同质化，正常细胞约可传30-50代，应及早冻存。

⏹衰退期：细胞增殖减慢，直至死亡。